电生理测量在中性转运体活性研究中的应用
Summary
本文介绍了质子选择性电极和膜片夹紧方法在质子传输系统中的应用。这些方法克服了一般用于研究质子转运活动的一些技术限制, 如灵敏度适中、时间分辨力和细胞内环境控制不足。
Abstract
离子通过细胞膜的传输确保了细胞内和外部的离子含量的精细控制, 这对于细胞存活是必不可少的。这些运输机制由专业运输者蛋白质的活动斡旋。具体来说, pH 动态是精细控制的等离子膜质子 (H+) 挤出系统, 如 Na+/H+交换器 (他) 蛋白家族。尽管广泛努力研究他规则的机制, 但我们目前对他家族的生物物理和分子性质的理解是不充分的, 因为有效地测量他活动的方法的有效性有限。.在这份手稿中, 我们使用了 h+选择性电极在全细胞膜膜片钳记录, 以测量他诱导的 h+通量。我们提出这种方法, 以克服一些典型的使用方法来测量他活动, 如放射性吸收和荧光膜 permeants 的一些限制。使用所述方法测量他活动, 可以提高灵敏度和时间分辨率, 更有效地控制胞内 H+浓度。H+-选择性电极基于这样一个事实, 即运输者活动在靠近细胞膜的附近产生离子梯度。一个 h+-选择性电极在一个重复的、振荡的方式上移动到和远离细胞膜, 记录一个依赖于 h+通量的电压差。当 h+-选择性电极用于检测从电池中移出的 h+磁通时, 采用全细胞构型的膜片钳法来控制细胞内离子的组成。此外, 应用巨型膜片钳技术, 不仅可以改变细胞内的组成, 不仅离子, 但也脂质。用该技术方法测定了他型 3 (NHE3) 的转运体活性, 研究了 phosphoinositides NHE3 调节的分子基础。
Introduction
离子和溶质在细胞膜上的传输对于细胞的存活和有机体的生存是必不可少的1。离子和溶质的选择性运输是通过一系列专门的通道和转运蛋白来实现的。这些蛋白质的突变往往导致各种临床条件, 呈现通道和转运蛋白潜在靶点的药理治疗1。遗憾的是, 了解通道和传送器功能和调节的机制通常受到可用来研究其活动的方法的限制2,3,4。
具体地说, 转运体可以大致分为两大类, 这取决于它们在溶质转运过程中是否改变了细胞跨膜电位: 改变 electrogenic 离子转运蛋白 [如,磷酸磷酸钠共运输 2a (NaPi2a), 钠钙交换器 (NCX), etc。或非改变的 electroneutral 离子转运体 [例如,钠-质子交换器 (他), 氯化钠 co 转运体, NaPi2c,等。利用放射性同位素和荧光膜-permeant 染料的吸收, 对两类转运体的活性进行了广泛的研究2。这两种方法都通过测量特定细胞质离子的体积浓度的变化来估计转运体的活动, 这两种方法都有局限性, 如灵敏度和时间分辨率, 以及对细胞内的控制不足。环境.事实上, 许多运输者的活动取决于运载的离子的细胞质集中 (例如, NHE3, NCX), 并且这些离子集中的变动在调控运输者活动将扮演一个重要角色2,3,5. 用经典方法对这些调节机构进行精确的测量是有限的。
为了克服这些限制, 膜片钳方法用于研究传送器活动2,6。具体地说, 自引用离子选择性电极 (太阳能)7,8与补丁夹紧系统相结合, 最近允许测量 electroneutral 传送器活动3,4,5. 太阳能根据事实运输者活动创造离子梯度在接近的接近度细胞膜。在一个重复的、振荡的时尚中, 移动到离细胞膜的一个势值记录了电压差 (µV)。电压差可以转换成离子通量的值, 使用的校准方法, 适用菲克的第一定律的扩散2,9。当太阳能被用来检测离子从细胞中移出的通量时, 采用膜片钳的方法来控制细胞膜电位和胞内离子组成。此外, 该巨型膜片钳技术的应用, 不仅可以修改的细胞内组成的离子, 但也脂质和蛋白质3,5。
总之, 膜片钳方法的通用性与其他方法相比, 研究运输活动, 使补丁夹紧适合克服这些其他方法的共同限制。自参照太阳能和膜片钳技术的结合提供了在严格控制的实验环境中测量 electroneutral 转运体活动的独特可能性, 并发现新的生物物理和分子细胞膜传输特性3,4,5。该方法已成功地用于研究他的活动。哺乳动物他蛋白家族催化胞外钠的 electroneutral 净交换 (na+) 的细胞内质子 (H+)10,11使用内向 Na+渐变。在哺乳动物中, 他蛋白家族包括11相关的蛋白质 (NHE1-9 和 NHA1-2) 和精子特异的他10,12,13。
NHEs (SLC9a 家族) 被发现无所不在在大多数生物体从简单的原到更高的真核生物和参与了各种重要的细胞功能10,11, 包括控制细胞盐防御原, 维持酸碱的稳态和细胞体积, 并调节各种专门上皮的盐和水的吸收10,12,14,15。通过几项研究, 确定了 NHEs 的关键生物学作用及其功能的意义;然而, 由于方法论上的限制, 很少有研究对哺乳动物 NHEs 的生物物理和分子性质进行调查.4。近年来, 自引用太阳能在全细胞贴片钳夹中的应用, 揭示了由离子、蛋白质和磷脂的细胞内浓度变化所调控的他异构体的新分子机制3, 4。
具体地说, 本手稿中提供的协议概述了研究他型 3 (NHE3) 的活动和规则的方法和方法, 这是一个在 Na+, Cl–, 小贩3的吸收中的主要参与者.刷膜的肾脏和肠道上皮细胞14,16。报告了 NHE3 活性对胞内 phosphoinositides (phosphatidylinositide 45–1,6-[pi (45) P2] 和 phosphatidylinositide 34, 5-三磷酸 [pi (34, 5] P3]) 灵敏度的新认识。细胞传输蛋白, 如通道和转运体, 由 phosphoinositides17调节, NHE3 直接绑定 pi (45) P2 和 pi (34, 5) P318。根据目前的文献, 无论是肌可能是相关的生理学或病理生理调节的 NHE35,18,19。我们的研究结果支持 pi (45) P2 和 pi (34, 5) P3 在调节 NHE3 活动中的单独角色。这种区别是可能的, 因为应用的伊势技术与全细胞膜片钳记录结合。这项技术还允许控制肌细胞的内容通过细胞内灌注不同的 phosphoinositides 在测量 NHE3 活动。
Protocol
Representative Results
Discussion
尽管运输者具有重要的作用, 但用于研究其活动的方法是无效和不充分的。一个限制是, 可用的方法测量离子运动介导的运输活动, 而不考虑波动的细胞内离子组成在实验中4。该方法确保了细胞外和胞内离子组成的精确控制, 并为修饰细胞内离子、蛋白质和脂质组成提供了有力的工具3,4,5。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢埃里克 Fishback (得梅因大学, 得梅因, 爱荷华州, 美国) 为他的协助拍摄和编辑视频。Dr. 标记多诺维茨 (约翰霍普金斯大学医学院, 巴尔的摩, 美国马里兰州) 提供了稳定表达 NHE3-wt 或 NHE3-YRK 的 PS120 成纤维样细胞。
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
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