Aplicação de medida de eletrofisiologia para estudar a atividade de transportadores de Electro-neutro
Summary
Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.
Abstract
O transporte de íons através das membranas celulares garante o controle fino de ião dentro e fora da célula que é indispensável para a sobrevivência da pilha. Estes mecanismos de transporte são mediados pela actividade de proteínas de transporte especializado. Especificamente, dinâmica de pH é finamente controlada por sistemas de extrusão de prótons (H+) de membrana plasmática, tais como o at+/h+ família de proteínas de cambista (NHE). Apesar de extensos esforços para estudar os mecanismos subjacentes Regulamento NHE, nossa compreensão atual das propriedades biofísicas e moleculares da família NHE é inadequada, devido à limitada disponibilidade de métodos para medir efetivamente a atividade NHE . Neste manuscrito, usamos H+-eletrodos seletivos durante a célula inteira remendo gravação aperto para medir o fluxo induzido por NHE H+ . Propusemos que esta abordagem para superar algumas limitações do normalmente usado métodos para medir atividade NHE, como absorção radioativa e fluorescente membrana permeants. Medição de atividade NHE, usando o método descrito permite alta sensibilidade e resolução de tempo e controle mais eficiente das concentrações intracelulares de H+ . H+-eletrodos seletivos são baseado no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. H+-elétrodo seletivo do movimento até e fora da membrana celular, de forma repetitiva, oscilatória registra uma diferença de tensão que é dependente do fluxo de H+ . Enquanto H+-eletrodos seletivos são usados para detectar o fluxo de H+ , movendo-se fora da célula, o método de braçadeira do remendo na configuração da célula inteira é utilizado para controlar a composição iônica intracelular. Além disso, aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lípidos. A atividade de transportador de NHE isoform 3 (NHE3) foi medida usando esta abordagem técnica para estudar a base molecular do Regulamento NHE3 pelo remodelamento.
Introduction
Transporte de íons e solutos através da membrana de plasma é essencial para a sobrevivência das células e, portanto, de organismos1. Transporte seletivo de íons e solutos é alcançado por uma matriz de canal especializado e proteínas de transporte. Mutações nestas proteínas geralmente resultam em uma variedade de condições clínicas, canal e transportador proteínas alvos em potencial para o tratamento farmacológico1de renderização. Infelizmente, compreender os mecanismos subjacentes a função canal e transportador e regulamento é muitas vezes limitada pelas abordagens disponíveis para estudar sua atividade2,3,4.
Especificamente, os transportadores podem ser mais ou menos sub divididos em dois grandes grupos, dependendo se eles alterar o potencial transmembrana da célula durante o transporte de solutos: os transportadores de íons electrogenic alterando [por exemplo, fosfato de sódio- co-transportador 2a (NaPi2a), trocador de sódio-cálcio (NCX), etc.] ou os transportadores não alteram de íon electroneutral [por exemplo, o trocador de sódio-próton (NHE), co transportador de cloreto de sódio, NaPi2c, etc.]. As atividades de ambas as classes de transportadores têm sido estudadas extensivamente usando captação de isótopos radioativos e membrana-permeant fluorescente tinja2. Ambas as abordagens estimam a atividade dos transportadores medindo mudanças na concentração de íons citoplasmáticos específicos em massa, e os dois métodos têm limitações, como moderada sensibilidade e resolução de tempo e controle inadequado do intracelular Milieu. Com efeito, a atividade de muitos transportadores é dependente da concentração citoplasmática dos íons realizadas (por exemplo, NHE3, NCX), e alterações nas concentrações desses íons são esperadas para desempenhar um papel significativo na regulação da atividade de transporte2 , 3 , 5. medição precisa destes mecanismos regulador é limitada usando métodos clássicos.
Para superar essas limitações, métodos de braçadeira do remendo são utilizados para estudar a atividade de transportador2,6. Especificamente, a auto-referência eletrodos íon-seletivos (ISEs)7,8 combinada com o sistema de fixação de patch foi recentemente autorizado a medição da actividade de transporte de electroneutral3,4 , 5. ISEs são baseada no fato de que a atividade de transporte cria um gradiente de íon nas proximidades da membrana celular. Um ISE movendo-se para e longe da membrana celular em um repetitivo, moda oscilatória registra uma diferença de tensão (MV). Diferenças de voltagem podem ser convertidas em valores de fluxo de iões utilizando um método de calibração que se aplica a primeira lei de Fick da difusão2,9. Enquanto ISEs são usados detectar o fluxo de íons em movimento de células, o método de braçadeira do remendo em ambas as células inteiras ou configurações de dentro para fora é usado para controlar a composição iônica intracelular e potenciais de membrana. Além disso, a aplicação da técnica da pinça gigante patch permite a modificação da composição intracelular de íons, não só mas também lipídios e proteínas de3,5.
Em resumo, a versatilidade do método braçadeira remendo comparado com que outros métodos para estudar atividade de transporte fez remendo aperto apropriado para superar as limitações comuns destes outros métodos. A combinação de auto-referência ISEs e técnicas de braçadeira do remendo oferece a possibilidade única para medir a atividade dos transportadores de electroneutral em um ambiente experimental rigidamente controlado e descobrir romance biofísico e molecular Propriedades da membrana celular de transporte3,4,5. Esta abordagem tem sido usada com sucesso para estudar a atividade do NHE. A família de proteínas mamífera NHE catalisa o intercâmbio líquido de electroneutral de sódio extracelular (Na+) para intracelular próton (H+)10,11 , utilizando um gradiente at+ para dentro. Nos mamíferos, a família de proteínas NHE inclui 11 proteínas relacionadas (NHE1-9 e NHA1-2) e um esperma específico NHE10,12,13.
Laiane (família SLC9a) é encontrados ubiquitously na maioria dos organismos vivos de simples procariontes para eucariontes superiores e está envolvidos em uma variedade de células vitais funções10,11, inclusive controlando a defesa de salinidade de célula em procariontes, mantendo o volume de homeostase e célula de ácido-base e regula a absorção de água e sal em vários epitélios especializados10,12,14,15. As funções biológicas chaves de laiane e a importância das suas funções foram determinados através de vários estudos; no entanto, alguns estudos têm investigado as propriedades biofísicas e moleculares de mamíferos laiane devido a limitações metodológicas4. Recentemente, a aplicação de auto-referência ISEs durante o aperto de células inteiras remendo revelou novos mecanismos moleculares de isoformas NHE regulamentadas por alterações nas concentrações intracelulares de íons, proteínas e fosfolipídios3, 4.
Especificamente, o protocolo fornecido neste manuscrito descreve os métodos e abordagens para estudar a atividade e o Regulamento de NHE isoform 3 (NHE3), um jogador importante na absorção de Na+, Cl–, HCO3– e fluido na membrana de fronteira escova do epitélio intestinal e renal14,16. Nova visão nas diferenças de sensibilidade do NHE3 atividade de remodelamento intracelular (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfato [PI (4,5) P2] e phosphatidylinositide 3, 4,5-trifosfato [PI(3,4,5]P3]) é relatado. Proteínas de transporte celular, tais como canais e transportadores, são regulamentadas pelo remodelamento17e NHE3 vincula diretamente tanto PI (4,5) P2 e P3 PI (3, 4,5)18. Com base na literatura atual, qualquer phosphoinositide pode ser relevante para a regulação fisiológica ou fisiopatológico da NHE35,18,19. Nossos resultados suportam funções separadas para PI (4,5) P2 e P3 de PI (3, 4,5) na regulação da atividade NHE3. Esta distinção foi possível graças à aplicação de técnicas ISE em combinação com gravação de braçadeira do remendo de células inteiras. Esta técnica também permite o controle do phosphoinositide conteúdo celular através da perfusão intracelular de remodelamento diferentes durante a medição da actividade NHE3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Apesar das funções cruciais de transportadores, os métodos disponíveis para estudar sua atividade são inadequado e ineficaz. Uma limitação é que os métodos disponíveis medem o movimento de iões mediado pela atividade de transporte, sem considerar as flutuações na composição iônica intracelular durante o experimento4. O método apresentado garante um controle preciso de composições de íon extracelular e intracelular e oferece uma poderosa ferramenta para modificar intracelular de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostaria de agradecer Eric Fishback (Universidade de Des Moines, Des Moines, Iowa, EUA) pela ajuda com gravação e edição de vídeo. As células de fibroblastos, como PS120 estàvel expressando NHE3-wt ou NHE3-YRK foram gentilmente cedidas pelo Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, EUA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
Riferimenti
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