電気生理学測定の電気中立運送者の活動を研究への応用
Summary
本稿では、プロトン電極やパッチク メソッドのプロトン輸送システムのアクティビティを計測への応用について説明します。これらのメソッドは、一般的に中等度の感度、時間分解能が不足して細胞内環境制御などのプロトン輸送活性を研究する使用される技術のいくつかの制限を克服します。
Abstract
細胞膜中のイオン輸送は細胞の生存に不可欠な細胞内外のイオン濃度の微調整を保証します。これらの転送機構は、専門にされた蛋白質の活動によって仲介されます。具体的には、pH の動態は、原形質膜プロトン (H+) 押出シ ステ ム、ナ+などによって制御される細かく/H+交換 (NHE) 蛋白質家族。NHE の調節機構を研究するための広範な努力にもかかわらず NHE 族の生物物理・分子の性質の私達の現在の理解は、NHE 活動を効果的に測定する方法の限られた供給のためは十分ではないです。.本稿では、我々 は H+を使用-全体セル中に電極パッチ クランプ記録 NHE 誘起 H+フラックスを測定します。提案した通常のいくつかの制限を克服するためにこのアプローチは、放射性の取り込みなど蛍光膜定性、NHE の利用状況を測定するためのメソッドを使用します。記述法を用いた NHE 活性の測定により、細胞内の H+濃度のより効率的なコントロールと時間分解能高感度。H+-電極がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。H+-への移行と繰り返し、振動方法で細胞膜から離れた電極記録電圧差 h+に依存しています。一方、H+-H+フラックス全体セル構成でパッチ クランプ メソッドを使用して、細胞内のイオン組成を制御する、セルの外に移動を検出する電極を使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質の細胞内構成の変更ができます。NHE アイソ フォーム 3 (NHE3) の輸送活動はイノシトールリン脂質により NHE3 調節の分子基盤の研究にこの技術的なアプローチを使用して測定しました。
Introduction
イオンとプラズマ膜における溶質の輸送は細胞のと、それゆえ、生物1の生存に不可欠です。溶質とイオンの選択的輸送は専門にされたチャネルおよび蛋白質の配列によって実現されます。さまざまな病態、薬物治療1のチャネルやトランスポーター蛋白質の潜在的なターゲットをレンダリングしばしばこれらの蛋白質の突然変異の結果します。残念ながら、チャネルやトランスポーターの機能と制御機構の解明は、しばしば制限のアクティビティ2,3、4を研究するのにアプローチで。
具体的には、トランスポーターがサブに分けることが彼らは溶質の輸送中における細胞膜電位を変更するかどうかに応じて 2 つの大規模なグループ: 無k イオン変更 [例えばナトリウム ・ リン酸輸送体共輸送体 2 a (NaPi2a)、ナトリウム カルシウム交換体 (NCX) など]。または非変更 electroneutral イオン運送者 [例えば、ナトリウム プロトン交換 (NHE)、塩化ナトリウム共輸送体、NaPi2c、等です。]。膜側の透過物の蛍光染料2やトランスポーターの両方のクラスの活動は広範囲の放射性同位体の取り込みを使用して検討されています。両方のアプローチは、特定の細胞質のイオンのバルク濃度の変化を測定することによってトランスポーターの活性を推定し、両者適度な感度と時間分解能と細胞内の管理不十分などの制限があります。環境。確かに、多くのトランスポーターの活性は細胞質 (例えばNHE3、NCX)、運ばれたイオン濃度に依存して、これらのイオン濃度の変化が輸送活動2の調節に重要な役割を果たすことが期待,3,5します。 これらの調節のメカニズムの正確な測定は古典的な方法を使用して制限されます。
これらの制限を克服するために、パッチ クランプ方法トランスポーター活性2,6が検討されます。具体的には、クランピング システム パッチ併用自己参照型イオン選択性電極 (ISEs)7,8は最近 electroneutral トランスポーター アクティビティ3,4の測定を許可しています。,5。 天気予報がトランスポーター活性細胞膜近くにイオン勾配を作成するという事実に基づいています。移動し、細胞膜の繰り返しから伊勢、振動のファッションは、電圧差 (μ V) を記録します。電圧の違いは、拡散2,9の Fick の最初の法律を適用する校正法を用いたイオン流束の値に変換できます。天気予報が使用されている間のうち移動イオンのフラックスを検出する細胞、両方の全細胞のパッチ クランプ法またはインサイド アウト構成膜電位および細胞内のイオン組成を制御するために使用します。また、巨大なパッチ ・ クランプの技術のアプリケーションには、イオンだけでなく、脂質とタンパク質の3、5の細胞内構成の変更ができます。
要約すると、パッチ クランプ法の汎用性は研究する他の方法の輸送活動が行ったことパッチはこれらの他のメソッドの一般的な制限事項を克服するために適切なクランプと比較されます。自己参照を示さなかったし、パッチク ランプ法の組み合わせが厳しく制御された実験環境における electroneutral トランスポーターの活性を測定して小説生物物理・分子を発見するユニークな可能性を提供しています細胞膜の性質は、3,4,5を転送します。このアプローチは、NHE の活動を研究する正常に使用されています。哺乳類 NHE タンパク質ファミリーは、内側の Na+グラデーションを利用した細胞内のプロトン (H+)10,11細胞外ナトリウム (Na+) の electroneutral ネット交換を触媒します。哺乳類で、NHE タンパク質ファミリーには、11 の関連蛋白質 (NHE1 9 および NHA1 2) と精子固有の NHE10,12,13が含まれています。
NHEs (SLC9a 族) 単純な原核生物から高等真核生物にほとんど生物で普遍的に発見され、さまざまな重要な細胞機能10,11で細胞の塩分防御を制御に関与しています。原核生物、酸基盤ホメオスタティス、細胞量を維持し、様々 な特殊な上皮10,12,14,15の塩と水の吸収を調節します。NHEs の重要な生物学的役割とその機能の重要性がいくつかの研究によって決定されています。ただし、いくつかの研究は、方法論の限界4のための哺乳類 NHEs 生物物理・分子特性を検討しました。最近では、自己細胞パッチク中に天気予報を参照するアプリケーションはイオン、タンパク質やリン脂質で3の細胞内濃度の変化によって規制されての NHE アイソ フォームの分子機構を明らかにしました。 4。
具体的には、この原稿の提供されるプロトコル概要方法や勉強活動と NHE アイソ フォーム 3 の規則 (NHE3) Na+、Cl–、HCO3– 、液の吸収の主要なプレーヤーのためのアプローチ、腎と小腸上皮14,16の刷子縁膜。細胞内イノシトールリン脂質 NHE3 活動の感度の違いに新しい洞察力 (phosphatidylinositide 4, 5-ビスリン酸 [PI (4, 5) P2] と phosphatidylinositide 3,4,5 三リン酸 [PI(3,4,5]P3]) が報告されます。チャンネルやトランスポーターなどの細胞輸送蛋白質はイノシトールリン脂質17、によって調整されるし、NHE3 は直接 PI (4, 5) P2 と P3 PI (3,4,5)18をバインドします。現在の文献に基づいて、いずれかのイノシトールリン脂質 NHE35,18,19の生理や病態生理学的規制に関連する可能性があります。我々 の調査結果は、PI (4, 5) P2 の PI (3,4,5) P3 NHE3 活性の調節の別のロールをサポートします。この区別は、全細胞パッチク ランプとの組み合わせで伊勢の技術の適用のため可能だった。この技法は、NHE3 活性の測定中に異なるイノシトールリン脂質の細胞内血流を介してホスホイノシチド携帯電話コンテンツのコントロールもできます。
Protocol
Representative Results
Discussion
トランスポーターの重要な機能、にもかかわらず彼らの活動を研究するメソッドがないと不十分です。1 つの制限は、使用可能なメソッドが実験4細胞内イオン組成の変動を考慮することがなくトランスポーター活性化イオンの動きを測定することです。提案手法により、細胞内外のイオン組成を正確に制御し、細胞内イオン、タンパク質と脂質組成3,</s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、撮影し、編集したビデオで彼の援助のエリック Fishback (デ モイン大学, デモイン、アイオワ州、米国) を感謝したいです。安定表現 NHE3 wt や NHE3 YRK PS120 線維芽細胞のような細胞は、博士マーク Donowitz (ジョンズ ・ ホプキンス大学医学、ボルティモア、MD、米国) によって提供された親切。
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
Riferimenti
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