تطبيق القياس الكهربية لدراسة نشاط الناقلين محايدة الكهربائية
Summary
ويصف هذه المخطوطة تطبيقات أقطاب انتقائية بروتون والتصحيح لقط أساليب لقياس نشاط نظم النقل بروتون. هذه الأساليب التغلب على بعض القيود المفروضة على التقنيات المستخدمة عادة لدراسة نشاط النقل بروتون، مثل الحساسية معتدل ووقت القرار ومراقبة الوسط داخل الخلية غير كافية.
Abstract
ويضمن نقل الأيونات خلال أغشية الخلية غرامة مراقبة محتوى أيون داخل وخارج الخلية التي لا غنى عنها لبقاء الخلية. آليات النقل هذه هي توسط أنشطة البروتينات المتخصصة الناقل. على وجه التحديد، ناعما يسيطر ديناميات الأس الهيدروجيني غشاء البلازما بروتون (H+) البثق النظم، مثل Na++ /H مبادل (نة) البروتين الأسرة. وعلى الرغم من الجهود المكثفة دراسة الآليات الكامنة وراء تنظيم نة، فهمنا الحالي للخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للأسرة نة غير كافية بسبب محدودية توافر أساليب لقياس فعالية النشاط نة . في هذه المخطوطة، استخدمنا ح+-أقطاب انتقائية خلال كامل الخلية التصحيح تسجيل لقط لقياس التدفق الناجم عن نة ح+ . واقترحنا هذا النهج للتغلب على بعض القيود التي تفرضها عادة تستخدم أساليب لقياس النشاط نة، مثل الإقبال المشعة والغشاء الفلورسنت بيرمينتس. يمكن قياس نشاط نة باستخدام الأسلوب هو موضح حساسية عالية ووقت القرار ومراقبة أكثر فعالية لتركيزات ح+ داخل الخلايا. ح+-أقطاب انتقائية يتم على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. ح+-القطب الانتقائي نقل تصل إلى وبعيدا من غشاء الخلية بطريقة متكررة ومتذبذبة سجلات فرق جهد اعتماداً على التمويه ح+ . بينما ح+–يتم استخدام أقطاب انتقائية للكشف عن التمويه ح+ تتحرك خارج الخلية، يتم استخدام أسلوب المشبك التصحيح في تكوين كل خلية للتحكم في تكوين أيون داخل الخلايا. وعلاوة على ذلك، يسمح تطبيق أسلوب المشبك التصحيح العملاقة بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا الدهون داخل الخلايا. تم قياس نشاط الناقل isoform نة 3 (NHE3) باستخدام هذا النهج التقني إلى دراسة الأساس الجزيئي للتنظيم NHE3 قبل فوسفوينوسيتيديس.
Introduction
نقل الأيونات والذوائب عبر غشاء البلازما ضروري لبقاء الخلايا، ومن ثم للكائنات الحية1. النقل الانتقائي من الأيونات والذوائب يتحقق من خلال مجموعة من القنوات المتخصصة والبروتينات الناقل. كثيرا ما تؤدي الطفرات في هذه البروتينات في مجموعة متنوعة من الظروف السريرية، مما يجعل القناة ونقل البروتينات أهدافا محتملة للعلاج الدوائي1. ولسوء الحظ، فهم الآليات الأساسية لوظيفة القناة والناقل والتنظيم غالباً ما تكون محدودة بالنهج المتاحة لدراسة عن النشاط2،،من34.
على وجه التحديد، الناقلين يمكن تقريبا دون تقسيمها إلى مجموعتين كبير تبعاً لما إذا كان أنهم تغيير إمكانيات transmembrane الخلية أثناء نقل الذوائب: الناقلون أيون وآﻻت تغيير [مثلاً -فوسفات الصوديوم 2a الناقل المشارك (NaPi2a)، مبادل الصوديوم-الكالسيوم (نك)، إلخ.] أو الناقلين غير تغيير أيون اليكترونيوترال [مثل مبادل الصوديوم-بروتون (نة)، وكلوريد الصوديوم الناقل المشارك، NaPi2c، إلخ.]. وقد درست أنشطة كل من الفئات من الناقلين على نطاق واسع باستخدام امتصاص نظائر المشعة والأصباغ الفلورية غشاء بيرمينت2. كلا النهجين تقدير نشاط الناقلين بقياس التغيرات في تركيز الجزء الأكبر من أيونات هيولى محددة، وكلا الأسلوبين على قيود، مثل حساسية معتدلة والقرار الوقت وعدم كفاية الرقابة من داخل الخلايا الوسط. وفي الواقع، نشاط العديد من شركات النقل تعتمد على تركيز أيونات يجري بها (مثلاً، NHE3، نك) هيولى، والتغيرات في تركيزات أيون هذه من المتوقع أن تلعب دوراً هاما في تنظيم نقل النشاط2 , 3 , 5-القياس الدقيق لهذه الآليات التنظيمية ويقتصر استخدام الأساليب الكلاسيكية.
للتغلب على هذه القيود، تستخدم أساليب المشبك التصحيح لدراسة نقل النشاط2،6. على وجه التحديد، ذات مرجعية ذاتية أقطاب الأيوني الانتقائي (الجمعية)7،8 جنبا إلى جنب مع التصحيح لقط النظام سمح مؤخرا بقياس اليكترونيوترال نقل النشاط3،4 , 5-الجمعية على أساس حقيقة أن يخلق نشاط الناقل تدرج أيون بالقرب من غشاء الخلية. بورصة اسطنبول نقل ما يصل إلى وبعيدا عن غشاء الخلية في المتكررة، أزياء متذبذبة سجلات فرق جهد (µV). الاختلافات الجهد يمكن تحويلها إلى قيم الجريان أيون باستخدام أسلوب معايرة التي يتم تطبيق أول قانون فيك للانتشار2،9. بينما يتم استخدام الجمعية للكشف عن تدفق الأيونات تتحرك من الخلايا، طريقة المشبك التصحيح في كلا كامل الخلية أو تكوينات من الداخل إلى الخارج يستخدم للتحكم في تكوين غشاء أيون داخل الخلايا والمحتملة. وعلاوة على ذلك، تطبيق تقنية المشبك التصحيح العملاقة يسمح بتعديل تكوين الأيونات ليس فقط ولكن أيضا3،الدهون والبروتينات5داخل الخلايا.
وباختصار، براعة الأسلوب المشبك التصحيح بالمقارنة مع أن نشاط الناقل جعلت من أساليب أخرى لدراسة تصحيح لقط مناسبة للتغلب على القيود الشائعة لهذه الأساليب الأخرى. المزيج من الذاتي الرجوع إلى الجمعية وتقنيات المشبك التصحيح يوفر إمكانية فريدة لقياس نشاط الناقلين اليكترونيوترال في بيئة تجريبية الخاضعة لأحكام الرقابة واكتشاف رواية الفيزيائية-الحيوية والجزيئية خصائص لغشاء الخلية النقل3،،من45. هذا النهج قد استخدمت بنجاح لدراسة نشاط نة. الأسرة البروتين نة الثدييات يحفز تبادل الصوديوم خارج الخلية (نا+) صافي اليكترونيوترال للبروتون داخل الخلايا (ح+)10،11 الاستفادة تدرج نا+ إلى الداخل. في الثدييات، وتضم الأسرة البروتين نة 11 البروتينات ذات الصلة (NHE1-9 و NHA1-2)، وخاصة بالحيوانات المنوية نة10،،من1213.
نيس (عائلة SLC9a) تم العثور على أوبيكويتوسلي في معظم الكائنات الحية من بدائيات النوى بسيطة إلى أعلى حقيقيات النوى ويشاركون في مجموعة متنوعة من الخلية الحيوية وظائف10،11، بما في ذلك السيطرة على الدفاع الملوحة الخلية في بدائيات النوى، الحفاظ على التوازن وخلية حجم حمض-قاعدة، وتنظم امتصاص الماء والملح في مختلف epithelia المتخصصة10،،،من1214،15. الأدوار البيولوجية الرئيسية من نيس وأهمية وظائفهم قد حددت من خلال العديد من الدراسات؛ ومع ذلك، حققت بضعة دراسات الخصائص الفيزيائية-الحيوية والجزيئية للثدييات نيس بسبب القيود المنهجية4. في الآونة الأخيرة، قد كشفت عن تطبيق الذاتي الرجوع إلى الجمعية أثناء تصحيح كامل الخلية لقط الآليات الجزيئية رواية من isoforms نة تخضع لتغييرات في تركيزات الأيونات والبروتينات وشكلها3، داخل الخلايا 4.
على وجه التحديد، يحدد البروتوكول المنصوص عليها في هذه المخطوطة بأساليب ونهج لدراسة النشاط وتنظيم isoform نة 3 (NHE3)، لاعبا رئيسيا في امتصاص Na+، Cl–،– HCO3والسوائل في فرشاة الحدود غشاء ابيثيليا الكلوية والمعوية14،16. نظرة جديدة إلى الاختلافات في حساسية النشاط NHE3 إلى فوسفوينوسيتيديس داخل الخلايا (فوسفاتيديلينوسيتيدي 4، 5-بيسفوسفاتي [P2 PI (4، 5)] وفوسفاتيديلينوسيتيدي 3,4,5-ثلاثي [PI(3,4,5]P3]) يقال. خلية النقل البروتينات، مثل القنوات والناقلين، وينظم فوسفوينوسيتيديس17، و NHE3 مباشرة تربط PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5)18. تستند إلى الكتابات الحالية، أما فوسفوينوسيتيدي يمكن أن تكون ذات صلة لتنظيم الفسيولوجية أو الفيزيولوجية المرضية NHE35،،من18إلى19. دعم النتائج التي توصلنا إليها أدوار منفصلة ل PI (4، 5) P2 و P3 PI (3,4,5) في تنظيم النشاط NHE3. وكان هذا التمييز ممكن بسبب تطبيق تقنيات بورصة اسطنبول في تركيبة مع تسجيل المشبك تصحيح كامل الخلية. يسمح هذا الأسلوب أيضا السيطرة على المحتوى فوسفوينوسيتيدي الخلوية عن طريق نضح داخل الخلايا من فوسفوينوسيتيديس مختلفة أثناء قياس النشاط NHE3.
Protocol
Representative Results
Discussion
وعلى الرغم من المهام الحاسمة للناقلين، الطرق المتاحة لدراسة نشاطها غير فعالة وغير كافية. قيد واحد أن الأساليب المتاحة قياس حركة أيون توسط نشاط الناقل دون النظر إلى التقلبات في تكوين أيون داخل الخلايا أثناء التجربة4. طريقة عرض يضمن مراقبة دقيقة من التراكيب أيون خارج الخلية ود?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف يود أن يشكر إريك فيشباك (جامعة دي موين، دي موين، آيوا، الولايات المتحدة الأمريكية) لمساعدته مع إطلاق النار وتحرير الفيديو. وقدم الدكتور مارك دونوويتز (جامعة جونز هوبكنز مدرسة الطب، بالتيمور، ماريلاند، الولايات المتحدة الأمريكية) يرجى الخلايا تنتجها الخلايا الليفية مثل PS120 ستابلي يعبر عن وزن NHE3 أو NHE3-يرك.
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
Riferimenti
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
