Anvendelse af Elektrofysiologi måling at studere aktiviteten af elektro-neutrale transportvirksomheder
Summary
Dette manuskript beskriver programmer af proton-ionselektive elektroder og patch fastspænding metoder til at måle aktivitet af proton transportsystemer. Disse metoder overvinde visse begrænsninger af teknikker, der almindeligvis anvendes til at studere proton transportaktiviteter, som moderat følsomhed, tidsopløsning og utilstrækkelig intracellulære milieu kontrol.
Abstract
Transport af ioner gennem cellemembraner sikrer den fine kontrol af ion indholdet i og uden for den celle, der er uundværlig for celle overlevelse. Disse transportmekanismer er medieret af aktiviteter af specialiserede transportør proteiner. Specifikt, pH dynamics styres fint af plasma membran proton (H+) ekstrudering systemer, som Na+h+ varmeveksler (NHE) protein familie. Trods omfattende bestræbelser på at studere de underliggende NHE forordning mekanismer, er vores nuværende forståelse af familien NHE biofysiske og molekylære egenskaber utilstrækkelig på grund af de begrænsede mængder af metoder til effektivt at måle NHE aktivitet . I dette manuskript, vi anvendte H+-ionselektive elektroder under hele-celle patch fastspænding optagelse for at måle NHE-induceret H+ flux. Vi har foreslået denne metode til at overvinde visse begrænsninger af typisk anvendes metoder til at måle NHE aktivitet, såsom radioaktivt optagelse og fluorescerende membran permeants. Måling af NHE aktivitet ved hjælp af den beskrevne metode giver høj følsomhed og tidsopløsning og mere effektiv kontrol af intracellulære H+ koncentrationer. H+-ionselektive elektroder er baseret på det faktum, at transportvirksomheden aktivitet skaber en ion gradient i umiddelbar nærhed af cellemembranen. En H+-selektiv elektrode bevæger sig op til og væk fra cellemembranen i et monotont, oscillerende mode registrerer en spændingsforskel, der er afhængige af H+ flux. Mens H+-ionselektive elektroder anvendes til at opdage H+ flux bevæger sig ud af cellen, metoden patch klemme i hele-celle-konfigurationen bruges til at styre den intracellulære ion-sammensætning. Desuden kan ansøgningen af kæmpe patch klemme teknik ændring af de intracellulære sammensætning af ioner, men også lipider. Transporter aktivitet af NHE isoform 3 (NHE3) blev målt ved hjælp af denne tekniske tilgang til at studere det molekylære grundlag af NHE3 regulering af phosphoinositides.
Introduction
Transport af ioner og opløste stoffer over plasmamembran er afgørende for overlevelse af celler og dermed af organismer1. Selektiv transport af ioner og opløste stoffer er opnået ved en række specialiserede kanal og transportør proteiner. Mutationer i disse proteiner ofte resultere i en række kliniske tilstande, rendering kanal og transportør proteiner potentielle mål for farmakologisk behandling1. Desværre, forstå de underliggende kanal og transporter funktion og regulering mekanismer er ofte begrænset af tilgange tilgængelige at studere deres aktivitet2,3,4.
Specifikt, transportvirksomheder kan være nogenlunde opdelt i to store grupper afhængig af om de ændre celle transmembrane potentiale under transport af opløste stoffer: ændre electrogenic ion transportvirksomhederne [f.eks., natrium-fosfat Co transporter 2a (NaPi2a), natrium-calcium exchanger (NCX), etc.] eller ikke at ændre electroneutral ion transportvirksomheder [f.eks., natrium-proton exchanger (NHE), natrium-klorid Co transporter, NaPi2c, etc.]. Aktiviteterne i begge klasser af transportvirksomheder er blevet studeret grundigt ved hjælp af optagelsen af radioaktive isotoper og fluorescerende membran-permeant farvestoffer2. Begge tilgange vurdere aktiviteten af transportvirksomheder ved at måle ændringer i bulk koncentrationen af specifikke cytoplasmatisk ioner, og begge metoder har begrænsninger, såsom moderat følsomhed og tidsopløsning og utilstrækkelig kontrol af den intracellulære milieu. Faktisk aktivitet for mange transportvirksomheder er afhængig af cytoplasmatisk koncentrationen af de foretages ioner (f.eks. NHE3, NCX), og ændringer i disse ion koncentrationer forventes at spille en betydelig rolle i reguleringen af transportør aktivitet2 , 3 , 5. præcis måling af disse regulerende mekanismer er begrænset brug af klassiske metoder.
For at overvinde disse begrænsninger, bruges patch klemme metoder til at studere transporter aktivitet2,6. Specifikt, har det selvrefererende ion-selektiv elektroder (ISEs)7,8 kombineret med patch fastspænding system for nylig tilladt måling af electroneutral transporter aktivitet3,4 , 5. ISEs er baseret på det faktum, at transportvirksomheden aktivitet skaber en ion gradient i umiddelbar nærhed af cellemembranen. En ISE bevæger sig op til og fra cellemembranen i en gentagne, registrerer oscillerende mode en spændingsforskel (µV). Spænding forskelle kan konverteres til ion flux værdier ved hjælp af en kalibreringsmetode, der gælder ficks første lov af diffusion2,9. Mens ISEs bruges til at registrere flux af ioner bevæger sig ud af celler, metoden patch klemme i begge hele-celle eller inside-out konfigurationer bruges til at styre membran potentiale og intracellulære ion sammensætning. Desuden kan ansøgningen af kæmpe patch klemme teknik ændring af de intracellulære sammensætning af ioner, men også lipider og proteiner3,5.
I Resumé sammenlignet alsidigheden i patch klemme metode med at transporter aktivitet af andre metoder til at studere har gjort en patch fastspænding egnet til at overvinde de fælles begrænsninger af disse andre metoder. Kombinationen af selvrefererende ISEs og patch klemme teknikker tilbyder den unikke mulighed for at måle aktivitet af electroneutral transportører i et stærkt kontrolleret miljø, eksperimentel og oplev roman biofysiske og molekylær egenskaber for celle membran transport3,4,5. Denne tilgang har held været anvendt til at studere aktiviteten af NHE. Pattedyr NHE protein familie katalyserer electroneutral netto udveksling af ekstracellulært natrium (Na+) til intracellulære proton (H+)10,11 udnytte en indadgående Na+ gradient. I pattedyr omfatter NHE protein familie 11 relaterede proteiner (NHE1-9 og NHA1-2) og en sæd-specifikke NHE10,12,13.
NHEs (SLC9a familie) findes allestedsnærværende i de fleste levende organismer fra simple prokaryoter til højere eukaryoter og er involveret i en række afgørende celle funktioner10,11, herunder kontrollere celle saltholdighed forsvar i prokaryoter, opretholdelse af syre-base homøostase og celle volumen, og regulere absorption af salt og vand i forskellige specialiserede epitheler10,12,14,15. De centrale biologiske roller i NHEs og betydningen af deres funktioner er blevet fastlagt gennem flere undersøgelser; dog har få studier undersøgt den biofysiske og molekylære egenskaber af pattedyr NHEs på grund af metodologiske begrænsninger4. For nylig, anvendelsen af selvrefererende ISEs under hele-celle patch fastspænding har afsløret roman molekylære mekanismer af NHE isoformer reguleret af ændringer i den intracellulære koncentration af ioner, proteiner og fosfolipider3, 4.
Specifikt, protokollen i henhold i dette manuskript skitserer de metoder og tilgange til at studere den aktivitet og regulering af NHE isoform 3 (NHE3), en vigtig aktør i absorptionen af Na+, Cl–, HCO3– og væske i den pensel grænse membranen af renal og tarm epitheler14,16. Nyt indblik i forskelle i følsomhed af NHE3 aktivitet til intracellulære phosphoinositides (phosphatidylinositide 4,5-bisfosfat [PI (4,5) P2] og phosphatidylinositide 3,4,5-triphosphat [PI(3,4,5]P3]) er rapporteret. Celle transport proteiner, som kanaler og transportvirksomheder, der er reguleret af phosphoinositides17, og NHE3 binder direkte både PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P318. Baseret på den aktuelle litteratur, kunne enten phosphoinositide være relevante for den fysiologiske eller patofysiologiske regulering af NHE35,18,19. Vores resultater støtter forskellige roller for PI (4,5) P2 og PI (3,4,5) P3 i reguleringen af NHE3 aktivitet. Denne sondring var muligt på grund af anvendelsen af ISE teknikker i kombination med hele-celle patch klemme optagelse. Denne teknik giver også mulighed for kontrol af phosphoinositide cellular indhold via den intracellulære perfusion af forskellige phosphoinositides under målingen af NHE3 aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trods de afgørende funktioner af transportvirksomheder er de metoder for at studere deres aktivitet ineffektive og utilstrækkelige. En begrænsning er, at de tilgængelige metoder måle ion bevægelse medieret af transporter aktivitet uden hensyn til udsving i intracellulære ion sammensætning under eksperimentet4. Metoden præsenteres sikrer præcis styring af ekstracellulære og intracellulære ion kompositioner og tilbyder en kraftfuld værktøj til at ændre intracellulære ion, proteiner o…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Eric Fishback (Des Moines Universitet, Des Moines, Iowa, USA) for hans bistand med optagelse og redigering af video. PS120 fibroblast-lignende celler stabilt udtryk for NHE3-wt eller NHE3-YRK blev venligst leveret af Dr. Mark Donowitz (Johns Hopkins University School of Medicine, Baltimore, MD, USA).
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
Riferimenti
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
