Elektrofizyoloji ölçüm uygulanması elektro-tarafsız taşıyıcılar etkinlik çalışması için
Summary
Bu el yazması proton taşıma sistemlerinin etkinliğini ölçmek için proton-seçici elektrot ve yöntemleri sıkma yama uygulamaları açıklar. Bu yöntemleri teknikleri proton taşıma etkinlik, ılımlı duyarlılık, zaman çözünürlüğü ve yetersiz hücre içi ortam denetimi gibi çalışma için yaygın olarak kullanılan bazı sınırlamalarının üstesinden gelir.
Abstract
İyonlarının hücre membranlar yoluyla taşıma iyon içeriği içinde ve hücre yaşam için vazgeçilmez bir hücre dışında ayrıntılı denetimini sağlar. Bu taşıma mekanizmaları özel taşıyıcı proteinler faaliyetleri tarafından aracılık. Özellikle, pH dynamics ince Na+gibi plazma zarı proton (H+) ekstrüzyon sistemleri tarafından kontrol edilir/h+ Eşanjör (NHE) protein ailesi. NHE yönetmelik temel mekanizmaları incelemek için kapsamlı çabalarına rağmen geçerli anlayışımız NHE aile biyofiziksel ve moleküler özelliklerinin etkili NHE etkinliği ölçmek için yöntemler sınırlı yer nedeniyle yetersiz . Bu makale, kullandığımız H+-bütün hücreli sırasında seçici elektrot yama NHE kaynaklı H+ akı ölçmek için sıkma kayıt. Biz genellikle bazı sınırlamaları aşmak için bu yaklaşım yöntemleri radyoaktif uptake ve floresan membran permeants gibi NHE etkinliği ölçmek için kullanılan önerdi. Açıklanan yöntemi kullanarak NHE etkinliğini ölçümü yüksek hassasiyet ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi H+ konsantrasyonları daha verimli kontrolünü sağlar. H+-seçici elektrotlar vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Bir H+-seçici elektrot kadar hareketli ve hücre zarının bir tekrarlayan, salınım moda uzakları H+ akı üzerinde bağımlı bir gerilim farkı kaydeder. Süre H+-seçici elektrot hareketli hücreden yama kelepçe yöntemi tüm hücreli yapılandırma hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır H+ akı algılamak için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulanması sadece da lipidler iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar. Işınlama aktivitesi NHE izoformu 3 (NHE3), moleküler temelini NHE3 yönetmelik çalışması için bu teknik yaklaşım kullanarak phosphoinositides tarafından ölçüldü.
Introduction
Taşıma iyonları ve solutes plazma zarı arasında hücre ve dolayısıyla, organizmalar1yaşam için önemlidir. Seçici taşıma iyonları ve solutes bir dizi özel kanal ve taşıyıcı proteinler tarafından sağlanır. Bu proteinler mutasyonların kez klinik koşulları, kanal ve taşıyıcı proteinler potansiyel hedefleri farmakolojik tedavi1için işleme çeşitli neden. Ne yazık ki, kanal ve ışınlama işlevi ve yönetmelik temel mekanizmaları anlama kez onların etkinlik2,3,4eğitim kullanılabilir yaklaşımlar tarafından sınırlıdır.
Özellikle, ışınlayıcılar kabaca olup onlar solutes taşıma sırasında hücre transmembran potansiyel alter bağlı olarak iki büyük gruba alt ayrılabilir: değiştirmek aşağıdaki sonuçlara yolaçabilir electrogenic iyon taşıyıcıları [Örneğin, sodyum-fosfat Co ışınlama 2a (NaPi2a), sodyum kalsiyum Eşanjör (NCX), vs.] veya electroneutral iyon değiştirme Işınlayıcılar [Örneğin, sodyum-proton Eşanjör (NHE), Sodyum Klorür co ışınlama odası, NaPi2c, vb.]. Taşıma araçları her iki çeşit faaliyetlerinin yoğun alımını radyoaktif izotoplar kullanılarak incelenmiştir ve floresan membran-permeant2boya. Her iki yaklaşımın belirli sitoplazmik iyonları toplu konsantrasyonu değişiklikleri ölçerek taşıyıcılar aktivitesini tahmin etmek, ve her iki yöntem kısıtlamaları, ılımlı duyarlılık ve zaman çözünürlüğü ve hücre içi yetersiz kontrolü gibi çevre. Gerçekten de, birçok taşıyıcıları etkinliği (Örneğin, NHE3, NCX) taşınan iyonların sitoplazmik konsantrasyon bağımlı olduğunu ve bu iyon konsantrasyonlarının değişimler ışınlama aktivitesi2 düzenlenmesinde önemli bir rol oynaması bekleniyor , 3 , 5. bu düzenleyici mekanizmaları hassas ölçümdür klasik yöntemlerle sınırlı.
Bu sınırlamalar üstesinden gelmek için yama kelepçe yöntemleri ışınlama aktivitesi2,6incelemek için kullanılır. Özellikle, sistem sıkma yama ile kombine self-referencing iyon-seçici elektrot (sorunum)7,8 son zamanlarda electroneutral ışınlama aktivitesi3,4 ölçümü sağladı , 5. sorunum vardır yakınında hücre membran bir iyon degrade ışınlama aktivitesi oluşturur gerçeğine dayanır. Taşımak ve hücre zarının bir tekrarlayan içinde uzak bir İMKB salınım moda bir gerilim farkı (µV) kaydeder. Gerilim farkları Difüzyon2,9Fick’ın ilk hukuk uygulayan bir kalibrasyon yöntemiyle iyon akı değerleri dönüştürülebilir. Sorunum ise dışarı-in hareket iyonları akı algılamak, hücreleri yama kelepçe yöntemi her iki bütün hücredeki veya iç-out yapılandırmaları membran potansiyeli ve hücre içi iyon kompozisyon denetlemek için kullanılır. Ayrıca, dev yama klemp tekniği uygulama sadece da lipidler ve proteinler3,5iyonları hücre içi bileşimi modifikasyonu sağlar.
Özetle, yama kelepçe yöntemi çok yönlülüğü ile çalışmak için diğer yöntemleri yama bu yöntemlerin ortak sınırlamaları aşmak uygun sıkma ışınlama aktivitesi yaptı karşılaştırıldığında. Kendi kendine referans sorunum ve yama kelepçe teknikleri ile birlikte electroneutral taşıyıcılar sıkı şekilde denetlenen bir deneysel ortamda etkinliğini ölçmek için ve roman biyofiziksel ve moleküler keşfetmek için benzersiz imkanı sunuyor Hücre zarı özellikleri3,4,5ulaşım. Bu yaklaşım, etkinliği NHE ile çalışmaya başarıyla kullanılmıştır. Memeli NHE protein ailesi ekstraselüler sodyum (Na+) electroneutral net değişimi için hücre içi proton (H+)10,11 bir içe Na+ degrade kullanan tromboksan. Memelilerde, 11 ilgili proteinler (NHE1-9 ve NHA1-2) ve sperm özgü NHE10,12,13NHE protein ailesi içerir.
NHEs (SLC9a aile) ubiquitously basit prokaryot gelen en canlı organizmalar daha yüksek Ökaryotlar bulunur ve hücre tuzluluk savunmak için kontrol dahil olmak üzere önemli hücre fonksiyonları10,11, çeşitli yer alırlar prokaryot, asit-baz homeostazı ve hücre Cilt Bakımı ve çeşitli özel epiteli10,12,14,15dakika sonra tuz ve su emilimini düzenleyen. NHEs kilit biyolojik rolü ve önemi işlevlerini çeşitli çalışmalar sayesinde tespit edilmiştir; Ancak, birkaç çalışmaları metodolojik sınırlamalar4nedeniyle memeli NHEs biyofiziksel ve moleküler özelliklerini araştırdı. Son zamanlarda, sorunum bütün hücreli yama sıkma sırasında kendi kendine başvuru uygulama değişiklikleri iyonları, proteinler ve fosfolipitler3hücre içi konsantrasyonlarda sahiplenilip NHE izoformlarının roman moleküler mekanizmaları ortaya koymuştur, 4.
Özellikle, bu el yazması gelen doğrulama yöntemleri ve etkinlik düzenlenmesi ve NHE izoformu 3 (NHE3), Na+, Cl–, HCO3– ve sıvı emme önemli bir oyuncu eğitimi için yaklaşımlar önerilmektedir Fırça sınır membran böbrek ve bağırsak epiteli14,16. NHE3 faaliyet duyarlılık farklar için hücre içi phosphoinositides içine yeni bir bakış açısı (phosphatidylinositide 4, 5-bisphosphate [PI (4,5) P2] ve phosphatidylinositide 3,4,5-trifosfat [PI(3,4,5]P3]) bildirdi. Cep taşıma proteinler, kanallar ve ışınlayıcılar, gibi phosphoinositides17tarafından düzenlenir ve NHE3 doğrudan PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P318bağlar. Geçerli edebiyat bağlı olarak, her iki fosfoinositid NHE35,18,19fizyolojik veya patofizyolojik düzenleme için ilgili olabilir. Cihazla ilgili izlenimlerimizi PI (4,5) P2 ve PI (3,4,5) P3 NHE3 faaliyetinin yönetmelikte ayrı roller destekler. Bu ayrım yüzünden bütün hücreli yama kelepçe kayıt ile birlikte İMKB tekniklerin uygulanması. Bu teknik aynı zamanda fosfoinositid hücresel memnun yolu ile farklı phosphoinositides hücre içi perfüzyon NHE3 etkinlik ölçümü sırasında kontrolünü sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Işınlayıcılar çok önemli işlevler rağmen faaliyetlerini incelemek kullanılabilir olan yöntemlerden etkisiz ve yetersiz. Kullanılabilir yöntemleri iyon hareketi sırasında deney4hücre içi iyon kompozisyon dalgalanmalar dikkate almadan ışınlama aktivitesi tarafından aracılı ölçmek bir kısıtlamadır. Sunulan yöntem ekstraselüler ve hücre içi iyon bestelerinden hassas kontrol sağlar ve hücre içi iyon, protein ve lipit kompozisyonları3,</sup…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Eric Fishback (Des Moines Üniversitesi, Des Moines, Iowa, ABD) çekim ve düzenleme video ile onun yardım için teşekkür etmek istiyorum. Stabil NHE3-wt veya NHE3-YRK ifade PS120 fibroblast benzeri hücreleri nazikçe Dr Mark Donowitz (Johns Hopkins Üniversitesi Tıp Fakültesi, Baltimore, MD, ABD) tarafından temin edilmiştir.
Materials
| Patch clamp Amplifier | Molecular Devices | ||
| Dual Channel Differential Electrometer (HiZ-223) | Warner Instruments | 64-1650 | |
| Differential Amplifier (DP-301) | Warner Instruments | 64-0044 | |
| Patch Clamp Software Based on MatLab | MatLab with acquisition toolbox | The capmeter software is recommended | |
| ThermoClamp-1 Temperature Control System | AutoMate Scientific | 03-11-LL | In-line heater |
| Single-Channel Temperature Controller (TC-324C) | Warner Instruments | 64-2400 | |
| Single-Barrel Standard Borosilicate Glass Tubing | World Precision Instruments | 1B120F-3 | Used for ion selective electrodes |
| Micropipette Storage Jar | World Precision Instruments | E212 | |
| Bis(dimethylamino)dimethylsilane | Sigma-Aldrich | 14755-100ML | |
| Carbon tetrachloride | Sigma-Aldrich | 319961-500ML | |
| Hydrogen ionophore I – cocktail B | Sigma-Aldrich | 95293 | |
| Thin Wall Borosilicate Tubing | Sutter Instrument | B200-156-15 | Used for patch clamp pipette |
| Soft glass (Corning 8161 Patch Glass) | Warner Instruments | 64-0815 | |
| Silica Capillary Tubing (150um OD/75um ID) | Molex (Polymicro Technologies) | 106815-0018 | Used for intra-pipette perfusion system |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium aspartate | Sigma-Aldrich | A6558 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M4880 | |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| MOPS | Sigma-Aldrich | M1254 | |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Tris | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
| Apyrase | Sigma-Aldrich | A6535 | |
| Phosphatidylinositol(4,5) bisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-4508 | |
| Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate diC8 | Echelon Biosciences | P-3908 | |
Riferimenti
- Rives, M. L., Javitch, J. A., Wickenden, A. D. Potentiating SLC transporter activity: Emerging drug discovery opportunities. Biochem Pharmacol. , (2017).
- Kang, T. M., Markin, V. S., Hilgemann, D. W. Ion fluxes in giant excised cardiac membrane patches detected and quantified with ion-selective microelectrodes. J Gen Physiol. 121 (4), 325-347 (2003).
- Babich, V., Vadnagara, K., Di Sole, F. The biophysical and molecular basis of intracellular pH sensing by Na+/H+ exchanger-3. FASEB J. 27 (11), 4646-4658 (2013).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Steady-state function of the ubiquitous mammalian Na/H exchanger (NHE1) in relation to dimer coupling models with 2Na/2H stoichiometry. J Gen Physiol. 132 (4), 465-480 (2008).
- Fuster, D., Moe, O. W., Hilgemann, D. W. Lipid- and mechanosensitivities of sodium/hydrogen exchangers analyzed by electrical methods. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (28), 10482-10487 (2004).
- Forster, I. C., Virkki, L., Bossi, E., Murer, H., Biber, J. Electrogenic kinetics of a mammalian intestinal type IIb Na(+)/P(i) cotransporter. J Membr Biol. 212 (3), 177-190 (2006).
- Smith, P. J., Trimarchi, J. Noninvasive measurement of hydrogen and potassium ion flux from single cells and epithelial structures. Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C1-C11 (2001).
- Parker, M. D., Musa-Aziz, R., Boron, W. F. The use of extracellular, ion-selective microelectrodes to study the function of heterologously expressed transporters in Xenopus oocytes. Am J Physiol Cell Physiol. 296 (5), C1243 (2009).
- Smith, P. J. S., Sanger, R. H., Messerli, M. A., Michael, A. C., Borland, L. M. . Electrochemical Methods for Neuroscience. , 373-406 (2007).
- Orlowski, J., Grinstein, S. Diversity of the mammalian sodium/proton exchanger SLC9 gene family. Pflugers Arch. 447 (5), 549-565 (2004).
- Brett, C. L., Donowitz, M., Rao, R. Evolutionary origins of eukaryotic sodium/proton exchangers. Am J Physiol Cell Physiol. 288 (2), C223-C239 (2005).
- Bobulescu, I. A., Di Sole, F., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers: physiology and link to hypertension and organ ischemia. Curr Opin Nephrol Hypertens. 14 (5), 485-494 (2005).
- Donowitz, M., Ming Tse, C., Fuster, D. SLC9/NHE gene family, a plasma membrane and organellar family of Na(+)/H(+) exchangers. Mol Aspects Med. 34 (2-3), 236-251 (2013).
- Zachos, N. C., Tse, M., Donowitz, M. Molecular physiology of intestinal Na+/H+ exchange. Annu Rev Physiol. 67, 411-443 (2005).
- Girardi, A. C., Di Sole, F. Deciphering the mechanisms of the Na+/H+ exchanger-3 regulation in organ dysfunction. Am J Physiol Cell Physiol. 302 (11), C1569-C1587 (2012).
- Bobulescu, I. A., Moe, O. W. Na+/H+ exchangers in renal regulation of acid-base balance. Semin Nephrol. 26 (5), 334-344 (2006).
- Hilgemann, D. W., Feng, S., Nasuhoglu, C. The complex and intriguing lives of PIP2 with ion channels and transporters. Sci STKE. (111), re19 (2001).
- Mohan, S., et al. NHE3 activity is dependent on direct phosphoinositide binding at the N terminus of its intracellular cytosolic region. J Biol Chem. 285 (45), 34566-34578 (2010).
- Alexander, R. T., et al. Membrane surface charge dictates the structure and function of the epithelial Na+/H+ exchanger. EMBO J. 30 (4), 679-691 (2011).
- Wang, T. M., Hilgemann, D. W. Ca-dependent nonsecretory vesicle fusion in a secretory cell. J Gen Physiol. 132 (1), 51-65 (2008).
- Hilgemann, D. W., Sakmann, B., Neher, E. . Single-Channel Recording. , 307-328 (1995).
- Hilgemann, D. W., Lu, C. C. Giant membrane patches: improvements and applications. Methods Enzymol. 293, 267-280 (1998).
- Matsuoka, S., Takeuchi, A., Okada, Y. . Patch Clamp Techniques. , 207-218 (2012).
- Pouyssegur, J., Sardet, C., Franchi, A., L’Allemain, G., Paris, S. A specific mutation abolishing Na+/H+ antiport activity in hamster fibroblasts precludes growth at neutral and acidic pH. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (15), 4833-4837 (1984).
- Voipio, J., Pasternack, M., MacLeod, K., Ogden, D. . Microelectrode Techniques – The Plymouth Workshop Handbook. , 275-316 (1994).
