يصف لنا أسلوب يعزز انجرافتمينت أورثوتوبيك من خلايا سرطان الرئة في الرئتين مورين بتكييف قبل الخطوط الجوية مع الإصابة. وهذا النهج يمكن أيضا أن تطبق لدراسة التفاعلات اللحمية داخل الرئة المكروية، نشر المنتشر، وسرطان الرئة المراضات المشارك، وأكثر كفاءة توليد المريض المستمدة تكثيفها.
سرطان الرئة هو مرض صهر علاج القاتل بيولوجيا غير متجانسة. هناك حاجة لفهم وعلاج فعال الطيف الكامل السريرية للأورام الخبيثة والصدر، نماذج حيوانية الإضافية التي يمكن إيجاز الأنواع الفرعية سرطان الرئة البشرية المتنوعة والمراحل. نماذج allograft أو xenograft تنوعاً وتمكين التحديد الكمي للقدرات الورمية في فيفو، باستخدام الخلايا الخبيثة أما مورين أو بشرية المنشأ. ومع ذلك، تم إجراء الأساليب المذكورة سابقا من سرطان الرئة الخلية انجرافتمينت في مواقع غير الفسيولوجية، مثل الجناح الفئران، بسبب عدم كفاءة أورثوتوبيك زرع الخلايا إلى الرئتين. في هذه الدراسة، يصف لنا طريقة لتعزيز engraftment خلية سرطان الرئة أورثوتوبيك من قبل التكييف الهوائية للفئران مع بليوميسين عامل حمل التليف. كتجربة من بين مفهوم الإثبات، قمنا بتطبيق هذا النهج انجرافت الخلايا السرطانية للرئة غدية النوع الفرعي، التي تم الحصول عليها من مصادر بشرية، أو الماوس في سلالات مختلفة من الفئران. نظهر أن إصابة الخطوط الجوية مع بليوميسين قبل حقن الخلايا السرطانية يزيد engraftment الخلايا السرطانية من 0-17% إلى 71-100%. عزز هذا الأسلوب كثيرا، حدوث ورم الرئة وثمرة اللاحقة باستخدام نماذج مختلفة وسلالات الماوس. وباﻹضافة إلى ذلك، نشر خلايا سرطان الرئة انجرافتيد من الرئتين إلى الأجهزة البعيدة ذات الصلة. وهكذا، نحن نقدم بروتوكول التي يمكن استخدامها لإنشاء وصيانة نماذج أورثوتوبيك جديدة من سرطان الرئة مع الحد من كميات من الخلايا أو بيوسبيسيمين وتقييم كمي الورمية قدرة خلايا سرطان الرئة في الإعدادات ذات الصلة فسيولوجيا .
سرطان الرئة هو أبرز سبب السرطان المتعلقة بالوفيات في جميع أنحاء العالم1. المرضى الذين يعانون من سرطان الرئة في نهاية المطاف الاستسلام من ورم خبيث على الأجهزة البعيدة، وخصوصا على الجهاز العصبي المركزي، والكبد، والغدد الكظرية، وعظام2،،من34. الأورام الخبيثة والصدر قد صنفت تقليديا كسرطان الرئة الخلية الصغيرة (مؤتمر القيادة المسيحية الجنوبية) أو (NSCLC) سرطان الرئة الخلية غير الصغيرة5. NSCLC هو الأكثر تواترا تشخيص الأورام الخبيثة ويمكن تقسيمها إلى أنواع فرعية نسيجية مختلفة، بما في ذلك الرئة غدية (لواد) والرئة الخلايا الحرشفية (لوس)6. وقد كشف تحليل الجينوم من سرطانات الرئة الابتدائي البشرية مستأصل أن الأورام داخل هيستوتيبي معين يمكن أيضا أن أعرب عن اضطرابات جزيئية متنوعة، كذلك المساهمة في تقدمهم سريرية متباينة والخلط في تشخيص المريض. إلى التباين الملحوظ من سرطانات الرئة تمثل تحديا كبيرا للتصميم العقلاني والتجارب قبل الإكلينيكية، وتنفيذ استراتيجيات علاجية فعالة. ونتيجة لذلك، هناك حاجة إلى توسيع مرجع نماذج سرطان الرئة التجريبية أصعب دراسة أصول الخلوية المتنوعة، والأنواع الفرعية الجزيئية، ومراحل لهذا المرض.
وقد استخدمت نهوج مختلفة باستخدام نماذج حيوانية لدراسة الرئة السرطان في فيفو، مع كل مزايا وعيوب اعتماداً السؤال (ق) البيولوجية لمصلحة. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيمس) يمكن أن تستهدف التعديلات الوراثية المحددة في نوع خلية السلف المعطاة، أسفر عن أورام أن التقدم داخل الأشخاص مضيف7. بينما قوية للغاية وذات الصلة سريرياً، الاعتلال الورم الكمون وتقلبه، و/أو الرئة المرتبطة جيممس يمكن أن تكون باهظة لبعض القياسات الكمية والكشف عن ورم خبيث المرحلة المتأخرة في الأجهزة البعيدة8. نهج تكميلي هو استخدام نماذج allograft، يتحمل فيها خلايا سرطان الرئة، الحصول عليها أما مباشرة من ورم ماوس أو مشتقة أولاً كخطوط الخلايا المحددة في الثقافة، وإعادة إدخالها إلى المضيفين سينجينيك. المثل، تقام تكثيفها سرطان الرئة من خطوط الخلايا البشرية أو عينات المرضى الورم المشتقة. تكثيفها خط الخلية البشرية أو تكثيفها المشتقة المريض (بدكسس) يتم الاحتفاظ بصفة عامة في الفئران المناعة وذلك يحول دون مراقبة المناعة كاملة9. وعلى الرغم من هذا العيب، فهي توفر سبيلاً للترويج للحد من كميات من البشرية بيوسبيسيمينس والدراسة الأساسية في فيفو خصائص الخلايا السرطانية البشرية، التي ترميز للانحرافات الجينية أكثر تعقيداً من الأورام جيم.
خاصية مفيدة واحدة من اللوجرافتس وتكثيفها أنها قابلة للتقليدية تحد خلية تمييع فحوصات، المستخدمة لقياس تكرار الورم استهلال الخلايا (التشنجات اللاإرادية) داخل خلية خبيثة سكان10. في هذه التجارب، وعدد محدد من الخلايا يتم حقن تحت الجلد في الجناح الحيوانات وتكرار التشنجات اللاإرادية يمكن تقديرها استناداً إلى معدل أخذ الورم. الأورام تحت الجلد ولكن يمكن أن يكون أكثر التاكسج11 وقد لا نموذج القيود الفسيولوجية الرئيسية للرئة وورم المكروية. إعطاء إيصال الظهارية الجذعية أو خلايا السلف في رئات الفئران أسلوب لدراسة تجديد الرئوية و بيولوجيا الخلايا الجذعية مجرى الهواء12. ومع ذلك، يمكن أن تكون معدل انجرافتمينت من هذا الأسلوب منخفضة نسبيا، إلا الرئتين أولاً تتعرض لأشكال الفسيولوجية للإصابة، مثل العدوى الفيروسية13،14. الدعم من الخلايا اللحمية التحريضية و/أو الإخلال بغشاء الرئة الطابق السفلي قد يحسن الإبقاء على الخلايا المزروعة إلى منافذ الخلايا الجذعية ذات الصلة في الخطوط البعيدة15. قبل التليف الذي يحفز وكلاء يمكن أيضا حالة الرئتين إلى تعزيز engraftment المستحثة pluripotent الخلايا16 و17من الخلايا الجذعية الوسيطة. ما إذا كان يمكن أن تؤثر على أشكال مماثلة من إصابة مجرى الهواء بمعدل انجرافتمينت، قدرة بدء الورم، ويعتبر امتداداً لخلايا سرطان الرئة لم أن تقيم بصورة منتظمة.
في هذه الدراسة، يصف لنا وسيلة لزيادة كفاءة engraftment خلية سرطان الرئة أورثوتوبيك، بتكييف قبل رئات الفئران مع الإصابة. لواد ينشأ في الخطوط الجوية البعيدة مع مجموعة فرعية كبيرة من هذه السرطانات النامية ستروما تليفية18 التي غالباً ما ترتبط بسوء التشخيص19. بليوميسين، ببتيد هجين نونريبوسومال طبيعية–بوليكيتيدي، وقد استخدمت على نطاق واسع للحث على التليف الرئوي في الفئران20. أولاً يعزز تقطير مجرى الهواء من بليوميسين الاستنزاف الظهارية في الحويصلات الهوائية وتجنيد الخلايا التحريضية، بما في ذلك الضامة والعدلات وحيدات21. ويعقب هذا الأنسجة يعيد البناء في الخطوط البعيدة والغشاء إعادة تنظيم22،23 و ترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM)24. آثار حقنه واحدة بليوميسين عابرة، مع التليف حل بعد 30 يوما في معظم الدراسات25. استخدام نماذج allograft وإكسينوجرافت، ونحن اختبار إذا قبل التكييف الهوائية للفئران مع بليوميسين يمكن زيادة كبيرة في معدل أخذ الخلايا لواد في الرئتين.
وقد وثقت يوازي السريرية ملفتة للنظر بين سرطان الرئة وغيره من الأمراض المزمنة ل الرئة36. على وجه الخصوص، المرضى الذين يعانون من تليف رئوي مجهول السبب (الحكومي) زيادة ميل لتطوير سرطان الرئة، وهذه الرابطة مستقلة عن التدخين التاريخ37،38. مقترحات تتسم…
The authors have nothing to disclose.
تم تمويل هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للسرطان (R01CA166376 و R01CA191489 إلى نغوين مركزي) ووزارة الدفاع (W81XWH-16-1-0227 إلى نغوين مركزي).
Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
6 well plate | Corning | C3516 | |
Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |