Pré conditionnement les voies respiratoires des souris à la bléomycine augmente l’efficacité de la prise de greffe orthotopique Lung Cancer Cell
Summary
Les auteurs décrivent une méthode pour améliorer significativement la greffe orthotopique de cellules de cancer du poumon dans les poumons murines en préconditionner les voies respiratoires avec des blessures. Cette approche peut également être appliquée pour étudier les interactions stroma dans le microenvironnement de poumon, la diffusion métastatique, la comorbidité de cancer du poumon, et pour produire plus efficacement les patients issus des xénogreffes.
Abstract
Cancer du poumon est une maladie réfractaire de traitement mortelle qui est biologiquement hétérogène. Pour comprendre et traiter efficacement le spectre clinique complète de malignités thoraciques, des modèles animaux supplémentaires qui peuvent récapituler les étapes et les sous-types de cancer de poumon humain diverses sont nécessaires. Une allogreffe ou xénogreffe modèles sont polyvalents et permettent la quantification des capacité tumorigènes in vivo, en utilisant des cellules malignes d’origine murine ou humaine. Cependant, les méthodes décrites précédemment de greffe de cellule pour le cancer du poumon ont été effectuées dans des sites non physiologiques, tels que le flanc de la souris, en raison de l’inefficacité de l’orthotopic transplantation de cellules dans les poumons. Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour améliorer la prise de greffe orthotopique lung cancer cell en préconditionner les voies respiratoires des souris avec la bléomycine agent inducteur de la fibrose. Comme une expérience de validation, nous avons appliqué cette approche pour greffer des cellules tumorales du sous-type adénocarcinome pulmonaire, provenant de souris ou de sources humaines, dans diverses souches de souris. Nous démontrons que blessant les voies respiratoires à la bléomycine avant l’injection de cellules de tumeur augmente la prise de greffe de cellules tumorales de 0 à 17 % de 71 à 100 %. Significativement, cette méthode améliorée incidence des tumeurs pulmonaires et une excroissance ultérieure à l’aide de différents modèles et les souches de souris. En outre, les cellules cancéreuses du poumon implantée diffusent des poumons dans des organes éloignés. Ainsi, nous fournissons un protocole qui peut être utilisé pour établir et maintenir de nouveaux modèles orthotopique du cancer du poumon avec la limitation des quantités de cellules ou recueillis et à évaluer de façon quantitative la capacité tumorigène des cellules cancéreuses du poumon dans les paramètres physiologiquement pertinents .
Introduction
Cancer du poumon est la principale cause de cancer liée décès dans le monde1. Patients atteints de cancer du poumon a finit par succombent de métastases à des organes éloignés, notamment pour le système nerveux central, foie, glandes surrénales et OS2,3,4. Tumeurs thoraciques ont été traditionnellement classées comme le cancer du poumon à petites cellules (CPPC) ou non-small cell lung cancer (NSCLC)5. NSCLC est le plus fréquemment diagnostiqué une tumeur maligne et peuvent être subdivisés en différents sous-types histologiques, y compris l’adénocarcinome pulmonaire (LUAD) et poumon épidermoïde (ULEMC)6. L’analyse génomique des cancers du poumon primaires humaines réséqués a révélé que les tumeurs au sein d’un histotype donné peuvent également exprimer diverses perturbations moléculaires, outre contribuant à leur progression clinique divergente et déconcertants pronostic patient. L’hétérogénéité remarquable des cancers du poumon représente un défi important à la conception rationnelle, les essais précliniques et mise en œuvre de stratégies thérapeutiques efficaces. Par conséquent, il y a lieu d’élargir le répertoire des modèles de cancer du poumon expérimental tractable pour étudier les diverses origines cellulaires et moléculaires sous-types stades de cette maladie.
Diverses approches à l’aide de modèles animaux ont été utilisés pour étudier lung cancer in vivo, chacun avec leurs propres avantages et inconvénients selon l’ou les questions d’intérêt biologiques. Modèles de souris génétiquement modifiées (edged) peuvent cibler des altérations génétiques spécifiques à un type de cellules progénitrices donnée, résultant dans les tumeurs que les progrès dans un hôte immunocompétent7. Bien qu’extrêmement puissant et cliniquement pertinents, la morbidité de tumeur de latence, variabilité, et/ou du poumon associée à Gregory peut être prohibitif pour certaines des mesures quantitatives et la détection des métastases de stade tardif dans des organes éloignés,8. Une approche complémentaire est l’utilisation de modèles d’allogreffe, par lequel cellules de cancer pulmonaire, obtenue directement auprès d’une tumeur de souris ou de dérivés d’abord comme les lignées cellulaires établies dans la culture, sont réintroduites en hôtes syngéniques. Par analogie, xénogreffes de cancer du poumon sont établies à partir des lignées cellulaires humaines ou des échantillons de patient tumeur dérivée. Xénogreffes de ligne de cellules humaines ou patients xénogreffes dérivés (PDXs) sont généralement conservées dans des souris immunodéprimées et interdit donc de surveillance immunitaire complète9. Malgré cet inconvénient, ils fournissent une avenue pour propager la limitation des quantités d’humains échantillons biologiques et l’étude fondamentale en vivo propriétés des cellules cancéreuses humaines, qui codent pour des aberrations génomiques plus complexes que les tumeurs GEMM.
Une propriété utile des allogreffes et xénogreffes, c’est qu’ils sont prêtent à des traditionnels essais de dilution cellules limitant, utilisés pour quantifier la fréquence de tumeur initiant des cellules (TICs) au sein d’une population de cellules malignes10. Dans ces expériences, un nombre défini de cellules est injecté par voie sous-cutanée dans le flanc des animaux et la fréquence des TICs peut être estimée selon le taux d’abonnement de tumeur. Tumeurs sous-cutanées cependant peuvent être plus hypoxique11 et ne peuvent pas modéliser principales contraintes physiologiques du microenvironnement tumoral de poumon. Livraison par voie intratrachéale de souches épithéliales ou cellules progénitrices dans les poumons des souris est une méthode pour étudier la régénération pulmonaire et bronchique stem cell biology12. Toutefois, le taux de prise de greffe de cette technique peut être relativement faible, à moins que les poumons sont d’abord soumis à des formes physiologiques de blessure, comme une infection virale13,14. Soutien de cellules stromales inflammatoires et/ou la rupture de la membrane basale de poumon peut améliorer la rétention des cellules transplantées dans les niches des cellules souches dans les voies respiratoires distales15. Fibrose induisant des agents peut également pré-conditionner les poumons afin d’améliorer la prise de greffe de cellules pluripotentes induites16 des cellules souches mésenchymateuses17. Si des formes similaires de lésion des voies aériennes peuvent influer sur le taux de prise de greffe, capacité initiatrice de la tumeur et la croissance des cellules cancéreuses du poumon doit encore être systématiquement évalués.
Dans cette étude, nous décrivons une méthode pour accroître l’efficacité de l’orthotopic lung cancer cellule prise de greffe, de préconditionner les poumons des souris atteintes de blessures. LUAD apparaît dans les voies aériennes distales avec un sous-ensemble important de ces cancers développant un stroma fibreux18 souvent corrélé avec le pronostic19. Bléomycine, un naturel synthases hybrides peptide-polykétide, a été largement utilisée pour induire une fibrose pulmonaire dans la souris20. L’instillation des voies aériennes de bléomycine favorise tout d’abord épithéliale attrition dans les alvéoles et le recrutement des cellules inflammatoires, y compris les macrophages, les neutrophiles et les monocytes21. Elle est suivie de tissu transformant en voies respiratoires distales, membrane basale réorganisation22,23 et matrice extracellulaire (ECM) dépôts24. Les effets d’une injection de bléomycine unique sont transitoires, fibro-résoudre après 30 jours dans la plupart des études25. À l’aide de modèles des allogreffes et xénogreffes, nous avons testé si préconditionner les voies respiratoires des souris à la bléomycine pourrait augmenter significativement le taux de cellules LUAD dans les poumons.
Protocol
Representative Results
Discussion
Frappant de parallels cliniques ont été recensées entre le cancer du poumon et autres maladies chroniques du poumon36. En particulier, les patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique (IPF) ont une prédilection accrue pour développer un cancer du poumon, et cette association est indépendante du tabagisme histoire37,38. IPF est caractérisée par une destruction progressive de l’architecture de poumon et fonction respiratoir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par des subventions de l’Institut National du Cancer (R01CA166376 et R01CA191489 à D.X. Nguyen) et le Department of Defense (W81XWH-16-1-0227 à D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
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