Pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina aumenta l'efficienza di Orthotopic del polmone cancro Engraftment delle cellule
Summary
Descriviamo un metodo per migliorare in modo significativo orthotopic engraftment delle cellule di cancro del polmone nei polmoni murini di pre-condizionamento delle vie aeree con la ferita. Questo approccio può essere applicato anche per studiare le interazioni stroma all’interno del microambiente polmonare, la disseminazione metastatica, la co-morbidità, cancro del polmone, e per generare in modo più efficiente paziente derivato xenotrapianti.
Abstract
Cancro del polmone è una malattia refrattaria di trattamento mortale che è biologicamente eterogenea. Per capire e trattare efficacemente lo spettro clinico completo delle malignità toracica, sono necessari ulteriori modelli animali che possono ricapitolare fasi e sottotipi di cancro del polmone umano diversi. Modelli dell’allotrapianto o dello xenotrapianto sono versatili e permettono la quantificazione della capacità tumorigeniche in vivo, utilizzando cellule maligne di origine umana o murina. Tuttavia, metodi precedentemente descritti del engraftment di cellula del cancro del polmone sono stati effettuati in siti non-fisiologica, come il fianco dei topi, a causa della inefficienza di trapianto orthotopic delle cellule nei polmoni. In questo studio, descriviamo un metodo per migliorare engraftment orthotopic del polmone cancro delle cellule di pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con la bleomicina agente d’induzione di fibrosi. Come un esperimento di proof-of-concept, abbiamo applicato questo approccio per attecchire le cellule del tumore del sottotipo dell’adenocarcinoma del polmone, ottenuti da mouse o fonti umane, in vari ceppi di topi. Dimostriamo che ferendo le vie respiratorie con bleomicina prima dell’iniezione di cellule di tumore aumenta l’attecchimento delle cellule del tumore da 0-17% a 71-100%. Questo metodo ha migliorato significativamente, l’incidenza del tumore del polmone e la conseguenza successiva utilizzando diversi modelli e diversi ceppi di topi. Inoltre, le cellule tumorali del polmone engrafted diffondono dai polmoni in pertinenti organi distanti. Quindi, mettiamo a disposizione un protocollo che può essere utilizzato per stabilire e mantenere nuovi modelli ortotopici del cancro polmonare con limitare le quantità di cellule o di biospecimen e di valutare quantitativamente la capacità tumorigenica delle cellule di cancro del polmone in impostazioni fisiologicamente rilevanti .
Introduction
Il cancro del polmone è la principale causa di cancro correlati morti in tutto il mondo1. Pazienti con cancro polmonare soccombono alla fine dalla metastasi agli organi distanti, in particolare per il sistema nervoso centrale, fegato, ghiandole surrenali e ossa2,3,4. Le malignità toraciche sono stati tradizionalmente classificate come carcinoma polmonare a piccole cellule (SCLC) o non a piccole cellule del polmone cancro (NSCLC)5. NSCLC è il più frequentemente diagnosticato malignità e può essere suddiviso in diversi sottotipi istologici, compreso l’adenocarcinoma del polmone (LUAD) e del polmone a cellule squamose (LUSC)6. Analisi genomica dei tumori polmonari primari umani resecato ha rivelato che i tumori all’interno di un determinato istotipo anche possono esprimere diverse perturbazioni molecolari, ulteriormente contribuire alla loro divergenti progressione clinica e prognosi paziente di confondimento. La notevole eterogeneità dei tumori polmonari rappresenta una sfida significativa per la progettazione razionale, sperimentazione pre-clinica e implementazione di strategie terapeutiche efficaci. Di conseguenza, c’è una necessità di ampliare il repertorio di trattabili sperimentale del polmone cancro modelli per lo studio della diversa origine cellulare, sottotipi molecolari e fasi di questa malattia.
Vari approcci utilizzando modelli animali sono stati impiegati per lo studio del polmone cancro in vivo, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi a seconda delle domande biologiche di interesse. Modelli murini geneticamente (GEMM) possono indirizzare specifiche alterazioni genetiche in un tipo di cellula progenitore determinato, con conseguente tumori che il progresso all’interno di un ospite immunocompetente7. Mentre estremamente potente e clinicamente rilevanti, la morbosità di tumore latenza, variabilità e/o polmonare connessa con GEMM può essere proibitiva per determinate misure quantitative e l’individuazione di metastasi ritardata di fase in organi distanti8. Un approccio complementare è l’utilizzo di modelli di allotrapianto, per cui le cellule tumorali del polmone, ottenuti direttamente da un tumore di topo o derivato in primo luogo come linee cellulari stabilizzate nella cultura, sono re-introdotte in syngeneic padroni di casa. Analogamente, gli xenotrapianti di cancro del polmone sono stabiliti da linee cellulari umane o campioni tumorali derivate paziente. Gli xenotrapianti di linea cellulare umana o pazienti derivati xenotrapianti (PDXs) vengono di solito mantenuti in topi immunocompromessi e pertanto precludono completa sorveglianza immunitaria9. Nonostante questo inconveniente, che forniscono un viale per propagare limitare importi umano biospecimens e studio fondamentale in vivo delle proprietà cellule tumorali umane, che codificano per più complesse aberrazioni che i tumori GEMM.
Una proprietà utile di allotrapianti e gli xenotrapianti è che essi sono suscettibili di tradizionale e limitante i saggi di diluizione di cellulare, impiegati per quantificare la frequenza del tumore che inizia le cellule (TICs) all’interno di una popolazione di cellule maligne10. In questi esperimenti, un numero definito di cellule vengono iniettato per via sottocutanea al fianco degli animali e la frequenza dei TIC possa essere stimata in base tasso di prendere del tumore. I tumori sottocutanei, tuttavia, possono essere più hypoxic11 e potrebbero non modellare i vincoli chiave fisiologici del microambiente del tumore del polmone. Consegna intratracheale di staminali epiteliali o cellule progenitrici nei polmoni dei topi è un metodo per studiare la rigenerazione polmonare e delle vie respiratorie della cellula formativa biologia12. Tuttavia, il tasso di attecchimento da questa tecnica può essere relativamente basso, a meno che i polmoni sono sottoposti prima a forme fisiologiche di ferita, quali infezione virale13,14. Supporto da cellule stromali infiammatorie e/o la rottura della membrana dello scantinato del polmone può migliorare la conservazione delle cellule trapiantate in nicchie di cellule staminali pertinenti nella vie aeree distali15. Fibrosi che inducono gli agenti può anche pre-condizione i polmoni di attecchimento di cellule pluripotenti indotte16 e cellule staminali mesenchimali17. Se altre forme simili di ferita della via aerea possono influenzare il tasso di attecchimento, capacità d’inizio del tumore e la conseguenza delle cellule di cancro del polmone ha ancora essere valutati sistematicamente.
In questo studio, descriviamo un metodo per aumentare l’efficienza di engraftment di orthotopic del polmone cancro delle cellule, di pre-condizionamento i polmoni dei topi con la ferita. LUAD si pone nelle vie aeree distali con un sottoinsieme significativo di questi cancri sviluppando un stroma fibrotico18 che spesso correla con la prognosi difficile19. Bleomicina, un peptide di ibrido naturale nonribosomal-polyketide, è stata ampiamente utilizzata per indurre fibrosi polmonare in topi20. Instillazione della via aerea di bleomicina promuove in primo luogo epiteliale logoramento in alveoli e il reclutamento di cellule infiammatorie, tra cui i macrofagi, neutrofili e monociti21. Questa è seguita da tessuto che ritocca le vie aeree distali, la membrana dello scantinato riorganizzazione22,23 e la deposizione di matrice extracellulare (ECM)24. Gli effetti di un’iniezione singola bleomicina sono transitori, con fibrosi risoluzione dopo 30 giorni nella maggior parte dei studi25. Utilizzando modelli dell’allotrapianto sia dello xenotrapianto, abbiamo testato se pre-condizionamento delle vie aeree dei topi con bleomicina potrebbe aumentare notevolmente il tasso di prendere delle cellule LUAD nei polmoni.
Protocol
Representative Results
Discussion
Analogie sorprendenti cliniche sono state documentate tra cancro ai polmoni e altre malattie croniche del polmone36. In particolare, i pazienti con fibrosi polmonare idiopatica (IPF) hanno una maggiore predilezione per sviluppare il cancro del polmone, e questa associazione è indipendente da fumo storia37,38. IPF è caratterizzata dalla distruzione progressiva dell’architettura del polmone e la funzione respiratoria alterata attraverso de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato da sovvenzioni dal National Cancer Institute (R01CA166376 e R01CA191489 a D.X. Nguyen) e il dipartimento della difesa (W81XWH-16-1-0227 a D.X. Nguyen).
Materials
| Bleomycin | Sigma | B5507-15UN | CAUTION Health hazard GHS08 |
| Exel Catheter 24G | Fisher | 1484121 | Remove needle. For intratracheal injection |
| Ketamine (Ketaset inl 100 mg/mL C3N 10 mL) | Butler Schein | 56344 | To anesthetize mice |
| Xylazine | Butler Schein | 33198 | To anesthetize mice |
| Ketoprofen, 5,000 mg | Cayman Chemical | 10006661 | Analgesic |
| Puralube Veterinary Ophthalmic Ointment | BUTLER ANIMAL HEALTH COMPANY LLC | 8897 | To prevent eye dryness while under anesthesia |
| D-Luciferin powder | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 122799 | For luminescent imaging. Reconstitute powder with PBS for a working concentration of 15mg/mL. Protect from Light |
| Rodent Intubation stand | Braintree Scientific | RIS-100 | Recommended stand for intratracheal injection |
| MI-150 ILLUMINATOR 150W MI-150 | DOLAN-JENNER INDUSTRIES | MI-150 / EEG2823M | To illuminate and visualize trachea |
| Graefe Forceps, 2.75 (7 cm) long serrat | Roboz | RS-5111 | For intratracheal injection |
| Syringe Luer-Lok Sterile 5ml | BD / Fisher | 309646 | |
| Satiny Smooth by Conair Dual Foil Wet/Dry Rechargeable Shaver | Conair | – | To shave mice |
| Bonn Scissors, 3.5" straight 15 mm sharp/sharp sure cut blades | Roboz | RS-5840SC | |
| 15 mL conical tube | BD / Fisher | 352097 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | USA SCIENTIFIC INC | 1615-5500 | |
| Vial Scintillation 7 mL Borosilicate Glass GPI | Fisher | 701350 | |
| Filter pipette tips (200 μL) | USA SCIENTIFIC INC | 1120-8710 | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies | 14190-144 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| DMEM high glucose | Life Technologies | 11965-092 | |
| RPMI Medium 1640 | Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum USDA | Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Amphotericin B | Sigma | A2942-20ML | |
| Trypan Blue Stain 0.4% | Life Technologies | 15250-061 | |
| Countess Automated Cell Counter | Life Technologies | AMQAX1000 | |
| Flask T/C 75cm sq canted neck, blue cap | Fisher / Corning | 353135 | |
| IVIS Spectrum Xenogen Bioluminiscence | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 124262 | For in vivo bioluminescence imaging |
| Living image software | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 128113 | For in vivo bioluminescence analysis |
| XGI-8 Gas Anesthesia System | Perkin Elmer Health Sciences Inc | 118918 | For Isoflurane anesthesia |
| BD Ultra-Fine II Short Needle Insulin Syringe 1 cc. 31 G x 8 mm (5/16 in) | BD / Fisher | BD328418 | For retro-orbital luciferin injection |
| Syringe 1ml | BD / Fisher | 14-823-434 | For intraperitoneal injections |
| 26 G x 1/2 in. needle | BD / Fisher | 305111 | For intraperitoneal injections |
| 4% Paraformaldehyde | VWR | 43368-9M | CAUTION Health hazard GHS07, GHS08. For fixing tissue |
| Pipet-Lite Pipette, Unv. SL-200XLS+ | METTLER-TOLEDO INTERNATIONAL | 17014411 | |
| Mayer's Hematoxylin | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 517-28-2 | |
| Eosin Y stain 0.25% (w/v) in 57% | Fisher | 67-63-0 | |
| Masson Trichrome Stain Kit | IMEB Inc | K7228 | For masson trichrome stain to visualize collagen |
| Superfrost plus glass slides | Fisher | 1255015 | |
| 6 well plate | Corning | C3516 | |
| Universal Mycoplasma Detection Kit | ATCC | 30-1012K | |
| OCT Embedding compound | ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES | 62550-12 | For embedding tissue for frozen sections |
| Leica CM3050 S Research Cryostat | Leica | CM3050 S | To section tissue for staining analysis |
| Keyence All-in One Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | |
| ImageJ | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/ download.html |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | – | |
| Athymic (Crl:NU(NCr)-Foxn1nu) mice | Charles River | NIH-553 | |
| NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) mice | Jackson Laboratories | 5557 | |
| B6129SF1/J mice | Jackson Laboratories | 101043 | |
| NIH-H2030 cells | ATCC | CRL-5914 | |
| 368T1 | generously provided by Monte Winslow (Standford University) | – | |
| PC9 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – | |
| H2030 BrM3 cells | Nguyen DX et al. Cell. 2009;138:51–62 | – |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2015. CA-Cancer J Clin. 65, 5-29 (2015).
- Gaspar, L. E. Brain metastases in lung cancer. Expert Rev Anticanc. 4, 259-270 (2004).
- Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
- Hoffman, P. C., Mauer, A. M., Vokes, E. E. Lung cancer. Lancet. 355, 479-485 (2000).
- Travis, W. D. Pathology of lung cancer. Clin Chest Med. 23 (1), 65-81 (2002).
- Chen, Z., Fillmore, C. M., Hammerman, P. S., Kim, C. F., Wong, K. K. Non-small-cell lung cancers: a heterogeneous set of diseases. Nat Rev Cancer. 14, 535-546 (2014).
- Kim, C. F., et al. Mouse models of human non-small-cell lung cancer: raising the bar. Cold Spring Harb Sym. 70, 241-250 (2005).
- Meuwissen, R., Berns, A. Mouse models for human lung cancer. Gene Dev. 19, 643-664 (2005).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501, 346-354 (2013).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat Rev Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Minchinton, A. I., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumours. Nat Rev Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Leblond, A. L., et al. Developing cell therapy techniques for respiratory disease: intratracheal delivery of genetically engineered stem cells in a murine model of airway injury. Hum Gene Ther. 20, 1329-1343 (2009).
- Vaughan, A. E., et al. Lineage-negative progenitors mobilize to regenerate lung epithelium after major injury. Nature. 517, 621-625 (2015).
- Zuo, W., et al. p63(+)Krt5(+) distal airway stem cells are essential for lung regeneration. Nature. 517, 616-620 (2015).
- Mahoney, J. E., Kim, C. F. Tracing the potential of lung progenitors. Nat Biotechnol. 33, 152-154 (2015).
- Wang, D., Morales, J. E., Calame, D. G., Alcorn, J. L., Wetsel, R. A. Transplantation of human embryonic stem cell-derived alveolar epithelial type II cells abrogates acute lung injury in mice. Mol Ther. 18, 625-634 (2010).
- Ortiz, L. A., et al. Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 8407-8411 (2003).
- Suzuki, K., et al. Prognostic significance of the size of central fibrosis in peripheral adenocarcinoma of the lung. Ann Thorac Surg. 69, 893-897 (2000).
- Cancer Genome Atlas Research, N. Comprehensive molecular profiling of lung adenocarcinoma. Nature. 511, 543-550 (2014).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF?. Am J Physiol-Lung C. 299, L439-L441 (2010).
- Hay, J., Shahzeidi, S., Laurent, G. Mechanisms of bleomycin-induced lung damage. Arch Toxicol. 65, 81-94 (1991).
- Vaccaro, C. A., Brody, J. S., Snider, G. L. Alveolar wall basement membranes in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Am Rev Respir Dis. 132, 905-912 (1985).
- Venkatesan, N., Ebihara, T., Roughley, P. J., Ludwig, M. S. Alterations in large and small proteoglycans in bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Am J Resp Crit Care. 161, 2066-2073 (2000).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol-Lung C. 294, L152-L160 (2008).
- Izbicki, G., Segel, M. J., Christensen, T. G., Conner, M. W., Breuer, R. Time course of bleomycin-induced lung fibrosis. Int J Exp Pathol. 83, 111-119 (2002).
- Schrier, D. J., Phan, S. H., McGarry, B. M. The effects of the nude (nu/nu) mutation on bleomycin-induced pulmonary fibrosis. A biochemical evaluation. Am Rev Respir Dis. 127, 614-617 (1983).
- Ponomarev, V., et al. A novel triple-modality reporter gene for whole-body fluorescent, bioluminescent, and nuclear noninvasive imaging. Eur J Nucl Med Mol I. 31, 740-751 (2004).
- Morten, B. C., Scott, R. J., Avery-Kiejda, K. A. Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell. J. Vis. Exp. , (2016).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. Quantitative bioluminescence imaging of mouse tumor models. Cold Spring Harbor protocols. , (2015).
- Byrne, F. L., McCarroll, J. A., Kavallaris, M. Analyses of Tumor Burden In Vivo and Metastasis Ex Vivo Using Luciferase-Expressing Cancer Cells in an Orthotopic Mouse Model of Neuroblastoma. Methods Mol Biol. 1372, 61-77 (2016).
- Parkinson, C. M., et al. Diagnostic necropsy and selected tissue and sample collection in rats and mice. J. Vis. Exp. , (2011).
- Tammela, T., et al. A Wnt-producing niche drives proliferative potential and progression in lung adenocarcinoma. Nature. 545, 355-359 (2017).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nat Protoc. 4, 1064-1072 (2009).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nat Rev Cancer. 17, 254-268 (2017).
- Nguyen, D. X., et al. WNT/TCF signaling through LEF1 and HOXB9 mediates lung adenocarcinoma metastasis. Cell. 138, 51-62 (2009).
- Raghu, G., Nyberg, F., Morgan, G. The epidemiology of interstitial lung disease and its association with lung cancer. Brit J Cancer. 91, S3-S10 (2004).
- Hubbard, R., Venn, A., Lewis, S., Britton, J. Lung cancer and cryptogenic fibrosing alveolitis. A population-based cohort study. Am J Resp Crit Care. 161, 5-8 (2000).
- Nagai, A., Chiyotani, A., Nakadate, T., Konno, K. Lung cancer in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. Tohoku J Exp Med. 167, 231-237 (1992).
- Rock, J. R., et al. Multiple stromal populations contribute to pulmonary fibrosis without evidence for epithelial to mesenchymal transition. Proc Natl Acad Sci USA. 108, E1475-E1483 (2011).
- Saito, Y., et al. Survival after surgery for pathologic stage IA non-small cell lung cancer associated with idiopathic pulmonary fibrosis. Ann Thorac Surg. 92, 1812-1817 (2011).
- Stevens, L. E., et al. Extracellular Matrix Receptor Expression in Subtypes of Lung Adenocarcinoma Potentiates Outgrowth of Micrometastases. Cancer Res. 77, 1905-1917 (2017).
- Harrison, J. H., Lazo, J. S. High dose continuous infusion of bleomycin in mice: a new model for drug-induced pulmonary fibrosis. J Pharmacol Exp Ther. 243, 1185-1194 (1987).
- Shcherbo, D., et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging. Nature Methods. 4, 741-746 (2007).
- Aso, Y., Yoneda, K., Kikkawa, Y. Morphologic and biochemical study of pulmonary changes induced by bleomycin in mice. Lab Invest. 35, 558-568 (1976).
- Kim, C. F., et al. Identification of bronchioalveolar stem cells in normal lung and lung. Cell. 121, 823-835 (2005).
- Fichtner, I., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenografts as models for the identification of predictive biomarkers. Clin Cancer Res. 14, 6456-6468 (2008).
- Zhang, X. C., et al. Establishment of patient-derived non-small cell lung cancer xenograft models with genetic aberrations within EGFR, KRAS and FGFR1: useful tools for preclinical studies of targeted therapies. J Transl Med. 11, 168 (2013).
