أسلوب نقل تتسم بكفاءة في المختبر بنظام جمال النوم ترانسكريبتيونالي الخاضعة للتنظيم في متجه تكامل لينتيفيرال معيبة وتعبئتها

Summary

ويصف هذا البروتوكول وسيلة تحقيق إدماج مورثة فائدة مستقرة في الجينوم البشري نظام النائمة للتنظيم ترانسكريبتيونالي. وترد إعداد التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة، وتوصيل في المختبر للخلايا البشرية والمقايسة الجزيئية في الخلايا ترانسدوسيد.

Abstract

ينقول النائمة (س. ب) نظام تكامل غير فيروسية مع أثبتت فعاليتها لنقل الجينات والجينوم الوظيفي. لتحسين إليه ينقول SB، يعملون ترانسبوساسي مفرط التنظيم ترانسكريبتيونالي (SB100X)، والمستندة إلى T2 ينقول. عادة، يتم توفير ترانسبوساسي وينقول عابر من تعداء بلازميد والتعبير SB100X تحركها مروج تأسيسي. وهنا، يمكننا وصف طريقة فعالة لتوصيل المكونات بينالي الشارقة إلى الخلايا البشرية التي مقاومة للعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية تعداء، التحكم في التعبير SB100X وإدماج [ستبلى] مورثة للفائدة (غوي) من خلال SB “قص ولصق” إليه. يتم التعبير عن ترانسبوساسي مفرط رقابة مشددة من جانب النظام على تيت، تستخدم على نطاق واسع للتحكم في التعبير الجيني منذ عام 1992. الجينات للاهتمام هو محاط يكرر مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من ينقول T2. يتم حزم كلا العنصرين بينالي الشارقة في التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة عابر تنتج في الخلايا HEK293T. الخلايا البشرية، أما من خطوط الخلايا أو الخلايا الأولية من الأنسجة البشرية، في المختبر ترانسدوسيد عابر مع النواقل الفيروسية. عند إضافة الدوكسي (دوكس، التتراسيكلين التناظرية) في المتوسط الثقافة، يقاس الضبط الدقيق للتعبير ترانسبوساسي والنتائج في على تكامل طويلة الأمد للجينات للفائدة في جينوم الخلايا المعالجة. هذا الأسلوب يتسم بالكفاءة وتنطبق على خط الخلية (مثل خلايا هيلا) والخلايا الأولية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية البشرية)، ويمثل بالتالي أداة قيمة للهندسة الوراثية ونقل الجينات العلاجية.

Introduction

تم بالفعل استخدام ترانسبوساسي SB100X مفرط بالإضافة إلى ينقول المستندة إلى T2 في الجينات السريرية العلاج التطبيقات^1،2،3، الجينوم التعديلات^4،5، و المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (اللجنة التوجيهية) إعادة برمجة^6،7. عادة، مكونات SB توفرها عابر تعداء بلازميد ومروج تأسيسي قوية التعبير عن ترانسبوساسي محركات الأقراص. ومع ذلك، يظل تقديم النظام المكون الثاني على الرغم من تحسين أساليب جديدة من تعداء، تحديا للعديد من التطبيقات. وهكذا، قد وضع بروتوكول جديد بإيصال اهتماما متزايداً. بالإضافة إلى طرق تعداء بلازميد⁸ ومرناً⁹، الفيروسية التسليم استناداً إلى أدينوفيرال^10،11، مرتبطة بالغدد الفيروسية (إف)¹²، باكولوفيروس¹³، جاماريتروفيرال¹⁴ وناقلات لينتيفيرال¹⁵ وقد اقترح في الماضي. جدير بالذكر أن نظام الاختيار يجب أن تضمن عملية تسليم عابر لمكونات SB دون التكامل بين النواقل الفيروسية. ومع ذلك، التعبير التأسيسي من ترانسبوساسي يثير الشواغل المتعلقة بالسلامة بسبب خطر ريهوبينج لا يمكن السيطرة عليها ينقول.

ولذلك، تنظيم النسخي SB100X بنظام على تيت المكرر هو التحدي الأول. مروج تيت مراعية معدلة، التي تم الحصول عليها عن طريق استبدال المروج المتقدمة الحد الأدنى الفيروس المضخم للخلايا (CMV) الأصلي مع المروج (-81) الحد الأدنى من الجينات تيميديني كيناز (المعارف التقليدية) من فيروس “الحلأ البسيط”-1 (هامبورغ-1)¹⁶، هو استنساخ المنبع كدنا SB100X (pTetOTKSB100X). تحور عكس-التتراسيكلين-ترانساكتيفاتور rtTA2^s-أعرب عن M2¹⁷ تحت سيطرة قوي التأسيسي المروج (المروج فوسفوجليسيراتي، PGK) المستنسخة في بلازميد مختلفة (بتشل-PGKrtTA2^S-M2). عند إضافة إلى متوسط الثقافة، يربط دوكس rtTA2^s-المغير M2 والحبال المروج تيت المعقدة، أو الناتجة عن ذلك في شكل محكم التنظيم الاستقراء من التعبير SB100X¹⁸.

التحدي الرئيسي الثاني ينشأ من تعداء الكفاءة البشرية الابتدائية الخلايا بالعديد من الأساليب الفيزيائية والكيميائية. لكفاءة تسليم ترانسبوساسي في الخلايا البشرية مقاومة تعداء، SB100X و rtTA2^s-شرائط التعبير M2 يتم حزم في اثنين التكامل ناقلات لينتيفيرال المعيبة (إيدلفس)¹⁹: إيدلفتكسب و IDLVrtTA2^s– M2. يتم إنتاج النواقل الفيروسية عابر كناقلات الجيل الثالث في الخلايا HEK293T²⁰ وبسيودوتيبيد مع بروتين سكري ز فيروس التهاب الفم فيسسيكولار (منظمة-ز)، الذي يمنح طائفة عريضة من العدوى. ناقل الجزيئات هي تتركز تنبيذ فائق ومعاير بفيروس نقص المناعة البشرية-1 “اسكت” إيمونوكابتوري p24. جسيمات ناقلات الرصاصية مع بوليبريني ترانسدوسي خطوط الخلايا والخلايا الأولية، وهي المحتضنة مع الخلايا المستهدفة في وجود أو عدم وجود دوكس. تفعيل مدمني المخدرات من التعبير SB100X في الخلايا ترانسدوسيد تقاس بكمية RT-PCR (قرة-PCR)¹⁸.

تحويل غوي (مثلاً، أخضر نيون البروتين، التجارة والنقل) إلى جينوم الخلية المستهدفة بمجرد يتجلى التعبير ينظم تيت SB100X، يتبع الأحداث الجزيئية وضوح المخططة ب باك وميكيلسن²¹. ثالث إيدلف ناقلات تحمل كاسيت تعبير لحكومة الهند استنساخ بين مصلحة الضرائب T2-ينقول (IDLVT2) وقد شيدت وتعبئتها كما هو مذكور أعلاه. وأخيراً، يمكن استخدام ثلاث ناقلات إيدلف كفاءة ترانسدوسي الخلايا البشرية (مثلاً، الكيراتينيه الأولية) في المختبر وإدماج غوي حضور الدوكسيسيكلين¹⁸.

Protocol

1-والبلازميدات المستخدمة ملاحظة: بلازميد بتشل-PGKrtTA2S-M2 كان يرجى قدمها الأستاذ زابافيجنا (جامعة مودينا وريدجو إميليا، مودينا، إيطاليا). بلازميد pCMVSB100X تحمل الترميز تسلسل ترانسبوساسي مفرط وبلازميد ينقول pT2/البوسنة والهرسك قدمت تفضلت بزين Z. إيفيكس (معهد بول ايرليك، أنغن، أ?…

Representative Results

استخدام الإجراء المعروضة هنا، ثلاث ناقلات إيدلف تحمل مكونات بينالي الشارقة ينظم (SB100X، rtTA2S-ينقول M2 وبروتينات فلورية خضراء-T2) تم تعبئتها واستخدامها لكفاءة تقديم وتنظيم أحكام نظام بينالي الشارقة في الخلايا البشرية. ويبين الشكل 1A مخطط في المختبر ?…

Discussion

هنا، يمكننا وصف منهجية متاحة على نطاق واسع لإدماج غوي ستابلي في جينوم الخلايا المستهدفة الجمال النائم-بوساطة تبديل. على الرغم من أن وضع نظام بينالي الشارقة لتوفير أسلوب فاجيناليس للتحرير الجينوم، تسليم كفاءة إليه التكامل (ترانسبوساسي وينقول T2) إلزامي. ولذلك، استخدام نظام بينالي الش?…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.