Un método de transposición eficiente In Vitro por un sistema de belleza durmiente transcripcionalmente regulada en un Vector lentivirales defectuosa integración

Summary

Este protocolo describe un método para lograr la integración estable del gen de interés en el genoma humano por el sistema transcripcionalmente regulado de La bella durmiente . Preparación de la integración de vectores lentivirales defectuosos, la transducción en vitro de las células humanas y el análisis molecular de células transduced se divulgan.

Abstract

El transposón Durmiente (SB) es un sistema integrador no virales con eficacia demostrada para la transferencia génica y genómica funcional. Para optimizar la maquinaria de transposon de SB, se emplean una transposasa hiperactiva transcripcionalmente regulada (SB100X) y transposones basada en T2. Típicamente, la transposasa y transposon transitoriamente por la transfección del plásmido y SB100X expresión es conducida por un promotor constitutivo. Aquí, describimos un método eficiente para entregar los componentes de la SB a las células humanas que son resistentes a varios métodos de transfección física y química, para controlar la expresión de SB100X y estable integrar un gen de interés (GOI) a través de un “cortar y pegar” SB mecanismo. La expresión de la transposasa hiperactiva es estrechamente controlada por el sistema de Tet-ON, ampliamente utilizado para controlar la expresión génica desde 1992. El gen de interés es flanqueado por repeticiones invertidas (IR) de los transposones de T2. Ambos componentes SB vienen en vectores lentivirales defectuosos transitorio producidos en células HEK293T integración. Las células humanas, líneas celulares o células primarias del tejido humano, están en vitro transduced transitoriamente con vectores virales. Además de doxiciclina (dox, análogo de la tetraciclina) en el medio de cultivo, un ajuste fino de la transposasa expresión se mide y da lugar a una integración duradera del gen de interés en el genoma de las células tratadas. Este método es eficaz y aplicable a la línea celular (por ejemplo, las células HeLa) y células primarias (por ejemplo, keratinocytes humanos primarios) y así representa una valiosa herramienta para la ingeniería genética y transferencia de genes terapéuticos.

Introduction

La transposasa hiperactiva de SB100X juntada al transposon basada en T2 ya se ha utilizado en preclínica gene terapia aplicaciones^1,2,3, genoma modificaciones^4,5, y célula de vástago pluripotent inducidas (iPSC) reprogramación^6,7. Típicamente, los componentes del SB son provistos transitoriamente por transfección del plásmido y un fuerte promotor constitutivo conduce la expresión de la transposasa. Sin embargo, a pesar de los nuevos métodos de mejora de la transfección, entrega del sistema de dos componentes sigue siendo un desafío para muchas aplicaciones. Así, el desarrollo de un nuevo protocolo de entrega tiene creciente interés. Además de métodos de transfección de plásmidos⁸ y mRNA⁹, entrega viral basado en adenoviral^10,11, adeno-associated virus (AAV)¹², Baculovirus¹³gammaretroviral¹⁴ y vectores lentivirales¹⁵ ha sido propuesto en el pasado. En particular, el sistema de elección debe garantizar una entrega transitoria de los componentes del SB sin integración del vector viral. Sin embargo, la expresión constitutiva de la transposasa plantea preocupaciones de seguridad debido al riesgo de rehopping incontrolable de los transposones.

Por lo tanto, la regulación transcripcional de SB100X por un refinado sistema de Tet-ON es el primer desafío. Se clona un promotor TTE responden modificado, obtenido mediante la sustitución del original promotor desarrollado mínimo citomegalovirus (CMV) con el promotor mínimo (-81) del gen Timidine quinasa (TK) del Virus del Herpes simple 1 (HSV-1)¹⁶, aguas arriba de la CDNA de SB100X (pTetOTKSB100X). La transformada inversa-tetraciclina-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ se expresa bajo el control del promotor constitutivo fuerte (fosfoglicerato promotor, PGK) clonado en un plásmido diferentes (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Cuando se añade al medio de cultivo, dox une el rtTA2^s-modulador M2 y anclar el promotor de Tet o complejo, dando como resultado una inducción bien regulada de SB100X expresión¹⁸.

El segundo gran reto surge de la ineficiente de la transfección de células primarias humanas por varios métodos físicos y químicos. Para administrar transposasa en células humanas resistentes a la transfección, la SB100X y la rtTA2^s-cassettes de expresión M2 vienen en dos integración vectores lentivirales defectuoso (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB y IDLVrtTA2^s– M2. Vectores virales se producen transitoriamente como tercer vectores de generación de células HEK293T²⁰ y pseudotyped con la glicoproteína G del Virus de la estomatitis Vescicular (VSV-G), que le confiere un amplio espectro de la infección. Las partículas de vector son concentradas por ultracentrifugación y graduadas por Inmunocaptura p24 de HIV-1 Gag. Para transducir las líneas celulares y células primarias, las partículas de vector son complexed con polibreno y se incuban con las células Diana en la presencia o ausencia de dox. Activación dependiente de la droga de SB100X expresión en células transduced se mide por RT-PCR (qRT-PCR) cuantitativa¹⁸.

Una vez que se demuestra expresión regulada de Tet SB100X, transposición de lo GOI (p. ej., proteína verde fluorescente, GFP) en el genoma de la célula objetivo sigue los eventos moleculares claramente esquematizados por Bak y Mikkelsen²¹. Un tercer IDLV vector llevar un casete de expresión para el GOI clonado entre el IRs transposon T2 (IDLVT2) tiene que ser construido y empaquetado como se mencionó anteriormente. Por último, los tres vectores IDLV pueden utilizarse para transducir las células humanas (por ejemplo, queratinocitos primarios) en vitro e integrar el GOI en presencia de doxiciclina¹⁸.

Protocol

1. los plásmidos empleados Nota: Plásmido pCCL-PGKrtTA2S-M2 fue amablemente proporcionado por Prof. Zappavigna (Universidad de Modena y Reggio Emilia, Módena, Italia). El plásmido de pCMVSB100X llevando la secuencia de codificación de la transposasa hiperactiva y el plásmido de transposon pT2/BH fueron amablemente proporcionadas por Prof Z. Ivics (Instituto de Paul Ehrlich, Langen, Alemania) y Prof. Z. Izvak (Max Delbruck centro de Medicina Molecular, Berlín, Alemania). <ol…

Representative Results

Utilizando el procedimiento presentado aquí, tres vectores IDLV llevar los componentes regulados de SB (SB100X, rtTA2S-transposon M2 y T2-GFP) eran empaquetados y brindar de manera eficiente y regular bien el sistema de SB en células humanas. Figura 1A se muestra un esquema para en vitro la transducción de las células HeLa, que fue realizada para evaluar la regulación transcripcional de la transposasa de SB con la mejor combinación d…

Discussion

Aquí, describimos una metodología ampliamente accesible para integrar estable un GOI en el genoma de las células de la blanco de La bella durmiente-mediada por transposición. Aunque el sistema de SB fue desarrollado para proporcionar un método nonviral para la edición del genoma, una entrega eficiente de la maquinaria de integración (transposasa y T2 transposon) es obligatoria. Por lo tanto, para utilizar el sistema de SB en células primarias apenas transfectable, una entrega viral de los componentes del…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.