Eine effiziente In-vitro- Umsetzung-Methode durch eine Transcriptionally geregelten Schönheit Schlafsystem verpackt in eine Integration defekt Lentivirale Vektor

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um stabile Integration eines Gens von Interesse des menschlichen Genoms durch das transcriptionally regulierte Dornröschen -System zu erreichen. Vorbereitung der Integration von defekten Lentivirale Vektoren, die in-vitro- Transduktion von menschlichen Zellen und molekulare Tests auf Zellen ausgestrahlt werden gemeldet.

Abstract

Das Transposon Sleeping Beauty (SB) ist ein nicht-viralen Integration System mit nachgewiesener Wirksamkeit für Gentransfer und funktionelle Genomik. Um die SB-Transposon-Maschinen zu optimieren, sind ein transcriptionally geregelten hyperaktiv Transposase (SB100X) und T2-basierte Transposon beschäftigt. In der Regel werden die Transposase und Transposons vorübergehend von Plasmid Transfektion und SB100X Ausdruck wird angetrieben von einem konstitutiven Promoter. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode um die SB-Komponenten an menschliche Zellen zu liefern, resistent gegen verschiedene physikalische und chemische Transfektion Methoden, SB100X Ausdruck zu steuern und stabil integrieren ein Gen des Interesses (GOI) durch eine “Ausschneiden und einfügen” SB Mechanismus. Der Ausdruck der hyperaktive Transposase wird durch das Tet-ON-System, häufig verwendet, um die Genexpression seit 1992 kontrollieren streng kontrolliert. Das gen des Interesses wird von invertierte Wiederholungen (IR) der T2 Transposons flankiert. Beide SB-Komponenten werden bei der Integration verpackt defektive Lentivirale Vektoren vorübergehend in HEK293T Zellen hergestellt. Menschliche Zellen, Zell-Linien oder primäre Zellen aus menschlichen Gewebe sind in-vitro- vorübergehend mit viralen Vektoren ausgestrahlt. Nach Zugabe von Doxycyclin (Dox, Tetracyclin analog) in das Kulturmedium eine Feinabstimmung der Transposase Ausdruck wird gemessen und ergibt eine dauerhafte Integration der das gen des Interesses in das Genom der behandelten Zellen. Diese Methode ist effizient und für die Zell-Linie (z. B. HeLa-Zellen) und primäre Zellen (z. B. menschliche primären Keratinozyten) und stellt somit ein wertvolles Werkzeug für Gentechnik und therapeutischer Gentransfer.

Introduction

Die hyperaktiven SB100X Transposase gekoppelt an das T2-basierte Transposon wurde bereits in präklinischen Gen Therapie Anwendungen^1,2,3, Genom Änderungen^4,5, verwendet und induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) Neuprogrammierung^6,7. In der Regel werden die SB-Komponenten vorübergehend von Plasmid Transfektion und starken konstitutiven Promoter treibt den Ausdruck der Transposase. Dennoch, trotz der verbesserten neuen Methoden der Transfektion Lieferung von zwei-Komponenten-System bleibt eine Herausforderung für viele Anwendungen. So hat die Entwicklung einer neuen Übermittlungsprotokoll zunehmendes Interesse. Neben Transfektion Methoden für Plasmid⁸ und mRNA⁹virale Lieferung basierend auf adenoviralen^10,11, Adeno-assoziierten Viren (AAV)¹², Baculovirus¹³gammaretroviralen¹⁴ und Lentivirale Vektoren¹⁵ hat in der Vergangenheit vorgeschlagen worden. Vor allem muss das System der Wahl eine vorübergehende Lieferung der SB-Komponenten ohne Integration des viralen Vektors garantieren. Dennoch wirft die konstitutive Expression von Transposase Sicherheitsbedenken wegen des Risikos einer unkontrollierbaren rehopping der das Transposon.

Transcriptional Regelung des SB100X durch ein raffiniertes Tet-ON-System ist daher die erste Herausforderung. Modifizierte Tet eine geschlechtergerechte Förderer, erreicht durch Ersetzen des original entwickelten minimal Cytomegalovirus (CMV) Projektträgers mit dem minimalen Promotor (-81) des Gens Timidine Kinase (TK) von Herpes Simplex Virus 1 (HSV-1)¹⁶, geklont stromaufwärts von der SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Die mutierten Reverse-Tetracyclin-Transaktivator rtTA2^s-M2¹⁷ drückt sich unter der Kontrolle von der starken konstitutiven Promoter (Phosphoglycerate Promotor, PGK) geklont in verschiedenen Plasmid (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Wenn das Kulturmedium hinzugefügt, Dox bindet die rtTA2^s-M2-Modulator und Leinen der Tet-Promoter komplexe oder daraus resultierenden in streng regulierten Induktion der SB100X Ausdruck¹⁸.

Die zweite große Herausforderung ergibt sich aus der ineffizienten Transfektion von menschlichen Primärzellen durch verschiedene physikalische und chemische Methoden. Um effizient Transposase in menschlichen Zellen resistent gegen Transfektion, die SB100X und die rtTA2^sliefern-M2 Expressionskassetten sind verpackt in zwei Integration defekt Lentivirale Vektoren (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB und IDLVrtTA2^s– M2. Virale Vektoren werden vorübergehend als dritte Generation Vektoren in HEK293T Zellen²⁰ und mit dem Glykoprotein G von vesikulärer Stomatitis Virus (VSV-G), die ein breites Spektrum an Infektion verleiht pseudotyped produziert. Vektor-Partikel sind durch Ultrazentrifugation konzentriert und von HIV-1 Gag p24 Immunocapture titriert. Um Zelllinien und Primärzellen transduzieren, Vektor-Partikel sind komplexiert mit Polybrene und mit Zielzellen in das Vorhandensein oder Fehlen von Dox inkubiert werden. Drogen-abhängige Aktivierung der SB100X Ausdruck in Zellen ausgestrahlt wird durch quantitative RT-PCR (qRT-PCR)¹⁸gemessen.

Tet-regulierten SB100X Ausdruck nachgewiesen wird, folgt Umsetzung der indischen Regierung (z. B. grün fluoreszierendes Protein, GFP) in die Ziel-Zelle-Genom der molekularen Ereignisse deutlich von Bak und Mikkelsen²¹schematisiert. Eine dritte IDLV Vektor-Ausführung hat eine Expressionskassette für die indische Regierung zwischen der T2-Transposon-IRs (IDLVT2) geklont zu konstruiert und verpackt, wie oben erwähnt werden. Die drei IDLV Vektoren ist zu guter Letzt lässt sich effizient transduzieren menschliche Zellen (z. B. primären Keratinozyten) in Vitro und integrieren die indische Regierung im Beisein von Doxycyclin¹⁸.

Protocol

(1) Plasmide eingesetzt Hinweis: Plasmid pCCL-PGKrtTA2S-M2 wurde freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Zappavigna (Universität von Modena und Reggio Emilia, Modena, Italien). Die pCMVSB100X Plasmid trägt die kodierende Sequenz des hyperaktiven Transposase und pT2/BH Transposon Plasmid wurden freundlicherweise von Prof. Z. Ivics (Paul-Ehrlich-Institut, Langen, Deutschland) und Prof. Z. Izvak (Max-Delbruck-Centrum für Molekularmedizin, Berlin, (Deutschland). <li…

Representative Results

Mit dem Verfahren präsentiert hier drei IDLV Vektoren tragen die regulierten SB-Komponenten (SB100X, rtTA2S-M2 und T2-GFP Transposon) wurden verpackt und verwendet, um effizient und straff regulieren das SB-System in den menschlichen Zellen. Abbildung 1A zeigt ein Schema für in-vitro- Transduktion von HeLa-Zellen, die durchgeführt wurde, die transkriptionelle Regulierung der SB Transposase mit die beste Dosis Kombination der beiden IDLV…

Discussion

Hier beschreiben wir eine allgemein zugängliche Methodik ein GOI stabil in das Genom der Zielzellen von Dornröschenzu integrieren-Umsetzung vermittelt. Obwohl das SB-System entwickelt wurde, um ein nonviral Verfahren für die Bearbeitung von Genom zu schaffen, ist die effiziente Bereitstellung der Integration Maschinen (Transposase und T2 Transposon) obligatorisch. Daher wurde eine virale Lieferung von SB-Komponenten um das SB-System auf kaum transfectable Primärzellen verwenden, in den letzten Jahren<sup cla…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.