En effektiv In Vitro transponering metode av Transcriptionally regulert sovende skjønnhet pakket i en integrasjon defekt Lentiviral vektor

Summary

Denne protokollen beskriver en metode for å oppnå stabil integrering av en genet av interesse i det menneskelige genomet av transcriptionally regulert Sleeping Beauty systemet. Utarbeidelse av integrering av defekte lentiviral vektorer i vitro Albin på menneskelige celler og molekylære analysen på transduced celler rapporteres.

Abstract

Sleeping Beauty (SB) transposon er en ikke-viral integrere med påvist effekt for genoverføring og funksjonell genomforskning. For å optimalisere SB transposon maskiner, er en transcriptionally regulert hyperaktiv transposase (SB100X) og T2-baserte transposon ansatt. Vanligvis, transposase og transposon tilbys transiently av plasmider transfection og SB100X uttrykk er drevet av en konstituerende promoter. Her beskriver vi en effektiv metode for å levere SB komponentene til menneskelige celler som er motstandsdyktig mot flere fysiske og kjemiske transfection metoder, til å kontrollere SB100X uttrykk og stabilt integrere en genet av interesse (GOI) gjennom en “klippe og lime” SB mekanisme. Uttrykk for hyperaktiv transposase er strengt kontrollert av Tet-på systemet, mye brukt til å kontrollere genuttrykk siden 1992. Genet av interesse er flankert av invertert gjentar (IR) av T2 transposon. Begge SB komponentene pakkes i integrering defekt lentiviral vektorer transiently produsert i HEK293T celler. Menneskelige celler, linjer eller primære celler fra menneskelig vev, er i vitro transiently transduced med viral vektorer. Ved tillegg av doxycycline (dox, tetracycline analog) til kultur medium, en finjustering av transposase uttrykk måles og resulterer i en varige integrasjon av genet av interesse i genomet av behandlet cellene. Denne metoden er effektiv og celle linje (f.eks HeLa celler) og primære keratinocytter (f.eks menneskelige primære), og dermed representerer et verdifullt verktøy for genteknologi og terapeutiske genoverføring.

Introduction

Den hyperaktiv SB100X transposase koblet til T2-baserte transposon er allerede brukt i preklinisk gene terapi programmer^1,2,3genom endringene^4,5, og indusert pluripotent stilk cellen (iPSC) omprogrammering^6,7. Vanligvis SB komponentene leveres transiently av plasmider transfection og en sterk konstituerende promoter stasjoner uttrykk for transposase. Men til tross for forbedret nye metoder for hva, levering av to-komponent er fortsatt en utfordring for mange programmer. Dermed har utviklingen av en ny levering protokoll økende interesse. Foruten transfection metoder for plasmider⁸ og mRNA⁹, viral levering basert på adenoviral^10,11, adeno-assosiert virus (AAV)¹², Baculovirus¹³, gammaretroviral¹⁴ og lentiviral vektorer¹⁵ har blitt foreslått i fortiden. Spesielt, må system av valget garantere en forbigående levering av SB komponenter uten integrering av viral vektoren. Likevel øker grunnleggende uttrykk for transposase sikkerheten bekymringer på grunn av risken ukontrollerbare rehopping av transposon.

Derfor er transcriptional regulering av SB100X av raffinerte Tet-ON den første utfordringen. En modifisert Tet-responsive promoter, ved å erstatte opprinnelige utviklet minimal cytomegalovirus (CMV) selskapet med minimal arrangøren (-81) av Timidine Kinase (TK) genet Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1)¹⁶, er klonet over den SB100X cDNA (pTetOTKSB100X). Den muterte omvendt-tetracycline-transactivator rtTA2^s-M2¹⁷ uttrykkes under kontroll av sterk konstituerende selskapet (phosphoglycerate promoter, PGK) klonet i en annen plasmider (pCCL-PGKrtTA2^S-M2). Når lagt til kultur medium, dox binder rtTA2^s-M2 modulator og tethers Tet arrangøren komplekse eller, resulterer i strengt regulert induksjon av SB100X uttrykk¹⁸.

Den andre store utfordringen oppstår fra den ineffektive transfection av menneskelige primære celler av flere fysiske og kjemiske metoder. Effektivt levere transposase i menneskeceller motstandsdyktig mot transfection, SB100X og rtTA2^s-M2 uttrykk kassetter er pakket inn i to integrasjon defekt lentiviral vektorer (IDLVs)¹⁹: IDLVTKSB og IDLVrtTA2^s– M2. Viral vektorer produseres transiently som tredje generasjon vektorer i HEK293T celler²⁰ og pseudotyped med glykoprotein G av Vescicular stomatitt viruset (VSV-G), som gir et bredt spekter av infeksjon. Vector partikler er konsentrert av ultracentrifugation og titreres med HIV-1 kneble p24 immunocapture. For å transduce linjer og primære celler, vektor partikler er kompleksbundet med polybrene og er ruges med målcellene i tilstedeværelse eller fravær av dox. Narkotikaavhengige aktivering av SB100X uttrykk i transduced celler er målt ved kvantitative RT PCR (qRT-PCR)¹⁸.

Når Tet regulert SB100X uttrykk er bevist, følger transponering av GOI (f.eks grønt fluorescerende protein, GFP) i målet cellen genomet molekylære hendelsene tydelig schematized av Bak og Mikkelsen²¹. En tredje IDLV vektor bærer et uttrykk kassett for GOI klonet mellom T2-transposon IRs (IDLVT2) har bygget og pakket som nevnt ovenfor. Endelig, tre IDLV vektorer kan brukes til å effektivt transduce menneskelige celler (f.eks primære keratinocytter) i vitro og integrere GOI i nærvær av doxycycline¹⁸.

Protocol

1. plasmider ansatt Merk: Plasmider pCCL-PGKrtTA2S-M2 ble vennlig levert av Prof Zappavigna (Universitetet i Modena og Reggio Emilia, Italia). Den pCMVSB100X plasmider frakter koding sekvensen av hyperaktiv transposase og pT2/BH transposon plasmider fotograferingen av Prof Z. Ivics (Paul Ehrlich Institute, Langen, Tyskland) og Prof Z. Izvak (Max Delbruck senter for molekylær medisin, Berlin, Tyskland). For alle kloning i Escherichia Coli (E. coli), følg…

Representative Results

Bruke fremgangsmåten presenteres her, tre IDLV vektorer bærer regulert SB komponentene (SB100X, rtTA2S-M2 og T2-GFP transposon) var pakket og brukes til å effektivt levere og tett regulere SB systemet i menneskeceller. Figur 1A viser en plan for i vitro signaltransduksjon HeLa celler, som ble utført for å evaluere transcriptional regulering av SB transposase med beste dose kombinasjon av to IDLV vektorer (rapportert i tabell 2…

Discussion

Her beskriver vi en allment tilgjengelig metode å integrere stabilt en GOI genomet av målcellene av Tornerose-mediert transponering. Selv om den SB-systemet ble utviklet for å gi en nonviral metode for genomet redigering, er effektiv levering av integrasjon maskiner (transposase og T2 transposon) obligatorisk. Derfor for å bruke SB-systemet på knapt transfectable primære celler, ble en viral levering av SB komponenter forfulgt i årene^10,12,</…

Materials

Dulbecco’s modified Eagle’s medium with 4.5g/L glucose w/o L-Glutamine	Lonza	BE12-614F	Cell culture medium.
HyClone Fetal Bovine Serum (U.S.), Characterized	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.03	Serum used HEK293T cell culture for lentiviral particle production.
Penicillin 10.000 UI/ml Streptomycin 10.000 UI/ml	Lonza	DE17-602E	Reagents for cell culture medium.
L-Glutamine 200mM	Lonza	BE17-605E	Reagent for cell culture medium.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Reagent for HBS 2X preparation.
HEPES Buffer, 1M Stock in normal saline	Lonza	BE17-737E	Reagent for HBS 2X preparation.
Disodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4·2H2O), 99.5%	Merck	106580	Reagent for HBS 2X preparation.
Hydrochloric acid – ACS reagent 37% (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	Reagent for HBS 2X preparation.
Sterile water for injection	Fresenius Kabi	–	Reagent for HBS 2X preparation.
0.45 µm PESS filter	Whatman	10462100	Filters used to remove cell debris from viral supernatant.
Polyallomer Beckman tubes	Beckman Coulter	326823	Tubes for concentrating IDLV vectors by ultracentrifugation.
PBS-1X w/o Ca, Mg	Lonza	BE17-516F	Buffer for cell wash and lentiviral particle resuspension.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A2153	(Optional) Buffer for lentiviral particle resuspension.
HIV-1 Gag p24 immunocapture kit	Perkin Elmer	NEK50001KT	Kit for IDLV particle titration.
Polybrene	Sigma-Aldrich	107689	Reagent to enhance transduction efficiency.
Trypsin (10X) 2.5% in HBSS w/o Ca, Mg	GIBCO	BE17-160E	Reagent to detach HeLa cells (stock solution, to be diluted).
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)	100938B	AnalaR BDH	Reagent for trypsin working solution preparation.
0.5% Trypsin-EDTA, no phenol red (10X)	GIBCO	15400-054	Reagent to detach keratinocytes (stock solution, to be diluted).
Donor Bovine Serum, New Zealand Origin	GIBCO	16030-074	Serum for Swiss mouse 3T3-J2 cell culture (feeder layer).
Ham’s F12 media	GIBCO	21765	Medium for keratinocytes.
Fetal bovine serum	Lonza	DE14-801F	Serum for HeLa cell culture medium.
Fetal Bovine Serum, qualified, Australia Origin	GIBCO	10099-141	Serum for human primary keratinocyte culture medium.
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I5500	Reagents for keratinocyte growth.
Adenine	VWR	1152-25	Reagents for keratinocyte growth.
Hydrocortisone	VWR	3867-1	Reagents for keratinocyte growth.
Cholera Toxin from Vibrio cholerae	Sigma-Aldrich	C8052	Reagents for keratinocyte growth.
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T5516	Reagents for keratinocyte growth.
Human EGF	Austral Biological	GF-010-9	Reagents for keratinocyte growth.
Mouse monoclonal APC-conjugated Anti-Feeder antibody	Miltenyi Biotech	130-096-099	To label feeder layer.
RNeasy Plus Mini Kit	Qiagen	74134	RNA purification kit.
SuperScript III Reverse Transcriptase	Life Technologies	18080051	Reverse transcriptase kit.
Deoxynucleotide Mix, 10 mM (dNTP)	Sigma-Aldrich	D7295	Reagent for semi-quantitative PCR.
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	(any)	–	Reagent for semi-quantitative PCR and for qRT-PCR.
GoTaq G2 Hot Start Polymerase	Promega	M740B	Taq polymerase.
Agarose, for molecular biology	Sigma-Aldrich	A9539	Reagent for agarose gel electrophoresis.
UltraPure TBE Buffer, 10X	Invitrogen	15581028	Reagent for agarose gel electrophoresis, to be dilute (1X) in ddH2O.
Ethidium bromide	Sigma-Aldrich	E1510	Reagent for agarose gel electrophoresis.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D-9891	drug to induce transposase expression in HeLa cells and in keratinocytes
TaqMan Universal PCR Master Mix	Applied Biosystem	4304437	TaqMan Universal PCR Master Mix including primers and probe.
15mL High Clarity polypropylene Centrifuge Tube, Conical Bottom, with Dome Seal Screw Cap, Sterile	Falcon Corning	352096	Tubes for cell collection and vector dilution preparation.
150 mm TC-Treated Cell Culture Dish with 20 mm Grid, Sterile	Falcon Corning	353025	Cell culture dish for viral production.
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid, Individually Wrapped, Sterile	Falcon Corning	353046	Cell culture plate for HeLa and human primary keratinocyte transduction.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 1.5 mL	Eppendorf	0030 120.086	Tubes for dilution preparation.
Safe-Lock microcentrifuge tubes, volume 2 mL	Eppendorf	0030 120.094	Tubes for dilution preparation.
0.2ml PCR Tubes with flat caps, RNase, DNase, DNA and PCR Inhibitor free	(any)	–	Tubes for semi-quantitative PCR.
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode, 0.1 mL	Applied Biosystem	4346906	96-well for qRT-PCR.
5mL Round Bottom Polystyrene Tube, without Cap	BD Falcon	352052	Tubes for flow cytometry acquisition.
Disposable Serological Pipets, Polystyrene, Individually Wrapped, Sterile (different volumes)	(any)	–	Pipettes for sterile tissue culture applications.
Filter Tips, Sterile, and RNase, DNase, DNA and Pyrogen free (different volumes)	(any)	–	Filter tips for sterile tissue colture and molecular biology applications.
pH meter	(any)	–	Equipment for measurement of HBS 2X pH.
PCR Thermal cycler	(any)	–	Equipment for semi-quantitative PCR.
Agarose gel electrophoresis equipment	(any)	–	Equipment for agarose gel electrophoresis of semi-quantitative PCR.
BD FACS Canto II 2LSR 4/2	BD	–	Flow cytometer.
7900HT Fast Real-Time PCR system	Applied Biosystem	7900HT	Equipment for qRT-PCR.
Benchtop centrifuges for efficient sample processing in cell culture applications, refrigerated, with microplate buckets.	(any)	–	Centrifuge for cell culture processing and spinoculation.
Optima L-90K Ultracentrifuge equipped with SW32TI rotor	Beckman Coulter	–	Ultracentrifuge for lentiviral particle production.
Equipment for cell culture and molecular biology laboratory (e.g., Class II laminar flow hood designed for work involving BSL2 materials, cell culture incubator,refrigerators and freezers (+4 °C, -20 °C, -80 °C), micropipettes and pipet-aid).
Protective laboratory coats, gloves, face protection in accordance with Institute rules and regulations, in particular for lentiviral particle production and transduction.