Грудное молоко способствует росту Enteroids: модель Ex Vivo пролиферации клеток
Summary
Этот протокол описывает, как создать систему enteroid культуры от новорожденных мыши или преждевременной кишечнике человека, а также эффективным методом для сбора молока от мышей.
Abstract
Человека малого кишечника enteroids являются производными от склепы и при выращивании в нише стволовых клеток содержат все типы эпителиальных клеток. Возможность установить человека enteroid ex vivo культуры систем являются важными модель кишечных патофизиологии и изучения конкретных клеточных реакций участвующих. В последние годы enteroids от мышей и людей будучи культивировали, пассированный и накренился прочь для будущего использования в нескольких лабораториях по всему миру. Этот enteroid платформа может использоваться для проверки последствий различных методов лечения и лекарств и какое воздействие оказываемое на различных типов клеток в кишечнике. Здесь протокол для создания первичного малого кишечника enteroids, стволовых клеток, полученных от новорожденных мышей и преждевременной кишечнике человека предоставляется. Кроме того эта система культуры enteroid был использован для тестирования эффекты вегетационных грудного молока. Мышь грудное молоко можно получить эффективно используя насос груди изменение человека и выразил мыши молоко может затем использоваться для дальнейших научных экспериментов. Мы теперь продемонстрировать последствия выраженных мыши, человека, и донорским грудным молоком на рост и распространение enteroids, полученных от новорожденных мышей или преждевременной человека тонкой кишки.
Introduction
Некротизирующего энтероколита (НЭК) является ведущей причиной смерти от болезни желудочно-кишечного тракта у недоношенных детей, затрагивающих почти 1 из 10 детей, родившихся до 29 недель гестации1,2,3. Половина детей с NEC прогресса наиболее тяжелой форме, где выживание является только4,10-30%5. В Соединенных Штатах примерно 2-3 млрд долларов США в год проводятся лечения грудных детей с NEC6,7, однако выживаемость ни терапия изменилась за последние 30 лет. Патогенез NEC характеризуется кишечных повреждений и нарушениями слизистых оболочек исцеления8,9,10,11, однако, сигнальных путей, ведущих к усугубляется воспалительной реакции и механизмы для обращения вспять воспаление по-прежнему неполно понял.
Было установлено, что администрацией человеческого грудного молока быть только Защитная стратегия против NEC для недоношенных детей. Ранее мы показали, что грудное молоко защищает от NEC развития путем ингибирования innate иммунных рецепторов Толл подобный рецептор 4 (TLR4) в эпителии кишечника через рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) сигнальный путь11. Добавок грудного молока экспериментальной NEC формулу ослабления воспалительной реакции, видели в NEC как показано ингибирование апоптоза энтероцитах и восстановление энтероцитах распространения в манере, которая зависит от роста эпидермиса фактор (EGF) и EGFR11. В другом исследовании было показано, что нитрат, другой компонент грудного молока, способствует ее защитного характера, модулируя кишечных перфузии, по сравнению с младенческой формулы, которая хватает нитрата и может способствовать увеличению частоты NEC в Формула вскармливаемых12,13. Другие соединения присутствует в грудном молоке, которые показали, чтобы быть вовлечены в защиту от NEC включают олигосахаридов грудного молока, L-аргинин, глютамин и лактоферрин14,,1516, 17,18,19. Эти выгодные элементы грудного молока выявить необходимость его использования в профилактике НЭК, но также подчеркивать важность изучения механизмов, сигнальные пути и сотовой эффекты причастны как грудное молоко посредничество защиту от NEC .
В целях дальнейшего изучения защитные свойства грудного молока в мыши модели NEC, мы разработали роман, простой в использовании метод, который мышью грудное молоко могут быть извлечены из наркотизированных плотины, используя электрические человека груди насос11,12 . Эта стратегия приобретения мыши грудное молоко является выгодным, не только потому, что насосы груди человека легко доступных и эффективных закупок грудного молока, но и потому, что этот метод позволяет для вегетационных грудное молоко анализов. В результате мы можем сравнить эффекты мыши грудное молоко с теми, кто выразил человеческого грудного молока, а также пастеризованное молоко человека доноров из молока банка в вегетационных моделей. Эта техника позволяет для изучения компонентов грудного молока по отношению к их вклад в предотвращение NEC. Другие исследователи разработали методы добычи грудное молоко, однако, эти методы ручной и обычно требуют более одной лаборатории член20,21,22. Здесь представлен простой техники, которые могут быть использованы, изменив человека Электрический насос груди для сбора молока от мыши. Этот метод также может быть применен к другим видам.
Чтобы адекватно допросить сигнальных путей, связанных с NEC, модель системы необходимы для оценки всех видов различных клеток, знаны, что будут затронуты в процессе болезни. Здесь мы обсуждаем один такой модели системы – enteroids – и их создание от мыши и человека тонкой кишки. В частности человека кишечные enteroids (ОДРДХ) предоставляют значительные перспективы, потому что они предлагают инновационные, генетически разнообразны ex vivo человека модель для помощи в изучении патофизиологических процессов, которые происходят в желудочно-кишечном тракте 23. Enteroids было установлено быть культивировали долгосрочный и может быть заморожен для последующего использования23, и в отличие от человека кишечные Organoids (HIOs), чьи культуры разработаны от индуцибельной плюрипотентных стволовых клеток, enteroids генерируются из стволовых клеток в течение24изолированных кишечные крипты. Enteroids требуют меньше обслуживания, могут быть заражены быстро25и может быть создана легко, поскольку кишечные крипты продифференцированы более чем HIOs23. Таким образом ОДРДХ предлагают много преимуществ над существующие методы, потому что они могут быть разработаны выставлять конкретного региона композиционные и функциональных свойств человека желудочно-кишечного эпителия23. Использование enteroids является весьма эффективным выбором когда нуждающихся человека модель кишечника, с соблюдением ограничений конкретного региона и простота в использовании. Здесь мы продемонстрировать технику изоляции и поддержания первичного стволовых клеток малого кишечника enteroids от мышей и недоношенных детей человеческих.
Protocol
Representative Results
Discussion
Кишечного эпителия состоит из многих клеточных подтипы, которые отвечают за предоставление узла обороны против патогенов, сохранение целостности кишки барьер и может быть нарушено в патогенезе ряда заболеваний. В то время как Животные модели можно резюмировать некоторые аспекты этог…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG поддерживается грантов, K08DK101608 и R03DK111473 из Департамента и национальных институтов здравоохранения, марта Dimes Фонд Грант № 5-FY17-79, Детская Discovery институт Вашингтонского университета и Сент-Луисе Детская больница Педиатрия в школе университета Washington микстуры, Сент-Луис. CJL поддерживается R01DK104946 (PI: Silverman), Университет Вашингтона Discovery Институт детской и Сент-Луисе Детская больница.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
