חלב מגבירה את הצמיחה של Enteroids: מודל לשעבר Vivo של התפשטות תאים
Summary
פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור מערכת התרבות enteroid העכבר neonatal או מוקדמת במעי האדם, כמו גם שיטה יעילה כדי לאסוף חלב עכברים.
Abstract
אדם קטן enteroids מעיים הם נגזרת של כוכים ומכילים כאשר גדל בגומחת תאי גזע כל סוגי תאים אפיתל. ויכולת ליצור אנושי enteroid ex-vivo תרבות מערכות חשובות פתופסיולוגיה מעיים דגם וכדי ללמוד את התגובות הסלולר מסוים מעורב. בשנים האחרונות, enteroids מן בעכברים ובבני אדם להיות מתורבתים, passaged, שהופקד משם לשימוש עתידי במעבדות מספר ברחבי העולם. הפלטפורמה enteroid יכול לשמש כדי לבדוק את ההשפעות של טיפולים ותרופות שונות ואת מה ההשפעות הן המופעל על סוגי תאים שונים במעי. . הנה, פרוטוקול להקמת העיקרי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids נגזר עכברים neonatal, מוקדמת במעי האדם הינו מסופק. יתר על כן, מערכת תרבות זו enteroid היה מנוצל כדי לבחון את ההשפעה של חלב אם ספציפית. חלב אם העכבר ניתן להשיג ביעילות באמצעות משאבה בשד האנושי שונה, ניתן להשתמש בעכבר ביטוי חלב לניסויים מחקר נוסף. כעת נדגים את ההשפעות של העכבר ביטוי, אנושי, התורם חלב על הגדילה ועל התפשטות enteroids נגזר neonatal עכברים או המעי הדק האנושי מוקדמת.
Introduction
דלקת מעי נמקית (NEC) הוא הגורם המוביל למוות ממחלות במערכת העיכול אצל פגים, להשפיע על כמעט 1 ב 10 תינוקות שנולדו לפני 29 שבועות ההיריון1,2,3. חצי של התינוקות עם התקדמות NEC הצורה החמורה ביותר, איפה הישרדות 10-30% רק4,5. בארצות הברית, 2-3 מיליארד USD/שנה משוערת מושקעים בטיפול בתינוקות עם NEC6,7, עדיין לא שיעור ההישרדות ולא טיפול השתנה במשך 30 השנים האחרונות. בפתוגנזה של NEC מאופיין על ידי פגיעה במעיים, ליקויי הרירית המרפא8,9,10,11, עם זאת, המסלולים איתות המובילים החמירה תגובה דלקתית ומנגנונים כדי להפוך את הדלקת נשארים שהיישום מובן.
הממשל של חלב אם אנושי נמצאה להיות האסטרטגיה רק מגן נגד NEC בפגים. אנחנו הראו בעבר כי חלב אם מגן מפני התפתחות NEC באמצעות עיכוב של הקולטן אגרה דמוי קולטן החיסון מולדים 4 (TLR4) של האפיתל במעי באמצעות הקולטן גורם הגדילה באפידרמיס (EGFR) איתות לשביל11. תוספת של חלב האם על נוסחת NEC ניסיוני attenuated את התגובה דלקתית אצל NEC כפי שמתואר על ידי עיכוב של אפופטוזיס enterocyte ושיקום של התפשטות enterocyte באופן הייתה תלויה גדילה עוריות פקטור (EGF) ו- EGFR11. במחקר אחר, זה הוצג כי טונות, רכיב אחר של חלב אם, תורמת טבעה מגן על ידי להתכוונן זלוף מעיים, לעומת פורמולה, אשר לוקה בחסר חנקתי, עשוי לתרום שכיחות מוגברת של NEC ב הנוסחה האכלת תינוקות12,13. תרכובות אחרות נוכח חלב אם הוכחו להיות מעורב ההגנה נגד NEC כוללים oligosaccharides חלב, L-ארגנין, גלוטמין, לקטופרין14,15,16, 17,18,19. רכיבים אלה מועילות של חלב האם לחשוף את נחיצות השימוש במניעה של NEC, אך גם להדגיש את החשיבות של לימוד המנגנון, איתות המסלולים ואפקטים הסלולר מעורבים כמה חלב היא תיווכה את ההגנה נגד NEC .
סדר כדי להמשיך לחקור תכונות ההגנה של חלב אם במודל של עכברים של NEC, פיתחנו שיטה חדשנית, קל לשימוש על ידי העכבר איזה חלב אם יכול להיות מופק של סכר anesthetized באמצעות חשמל בשד האנושי משאבת11,12 . אסטרטגיה זו של רכישת חלב אם העכבר הוא יתרון, לא רק כי הם השד אנושי משאבות זמינות ולא יעילה על הרכש של חלב אם, אלא גם כי שיטה זו מאפשרת ניתוח חלב השד ספציפית. כתוצאה מכך, אנו יכולים להשוות את ההשפעות של חלב אם העכבר עם אלה של חלב אם אנושי ביטוי כמו גם מפוסטר חלב האדם תורם מבנק חלב במודלים תלויי מין. טכניקה זו מאפשרת לצורך המחקר של רכיבי חלב השד ביחס התרומה שלהם כלפי מניעת NEC. חוקרים אחרים פיתחו שיטות שאיבת חלב השד, לעומת זאת, שיטות אלה נמצאים ידנית, מצריכים בדרך כלל אחד או יותר מעבדה חבר21,20,22. כאן מוצגת טכניקת קל זה יכול להיות מנוצל על ידי שינוי משאבה השד חשמלי אנושי לאסוף חלב מן העכבר. טכניקה זו ניתן להחיל גם למינים אחרים.
לחקור בצורה הולמת את איתות המסלולים מעורב עם NEC, דגם מערכות נדרשים להעריך את כל סוגי תאים שונים ידוע להיות מושפע מתהליך המחלה. כאן נדון אחד כזה מערכת מודל – enteroids – ואת הקמתן של העכבר והמעי הדק אנושי. Enteroids מעיים אנושיים (HIEs) לספק בפרט משמעותי ההבטחה, כי הם מציעים חדשני, מגוונת מבחינה גנטית שמחוץ האנושי מודל לסייע בחקר התהליכים הקשורים pathophysiological המתרחשים במערכת העיכול 23. Enteroids יש כבר מצאו להיות תרבותי לטווח ארוך שיכול להיות קפוא עבור שימוש מאוחר יותר23ו בניגוד האנושי Organoids מעיים (HIOs), אשר תרבויות מפותחות מתאי גזע inducible pluripotent, enteroids נוצרות מתאי גזע בתוך כוכים מעיים מבודד24. Enteroids דורשים תחזוקה פחותה, יכול להיות נגוע במהירות25, ניתן ליצור בקלות מאז כוכים מעיים מובדלים יותר מאשר HIOs23. לכן, HIEs מציעים יתרונות רבים על פני שיטות קיימות כי לפיתוח שהפגינו ספציפיים לאזור ההלחנה ופונקציונליים מאפייני האפיתל אנוש במערכת העיכול23. השימוש enteroids הוא בחירה יעילה ביותר כאשר צריך מודל אנושי של המעי, עם הדבקות ספציפיים לאזור מגבלות וחוסר נוחות השימוש. כאן אנחנו מדגימים את הטכניקה של בידוד ושמירה על ראשי נגזר תאי גזע קטן המעי enteroids עכברים, בפגים אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
האפיתל במעי מורכב יחוברו הסלולר רבים אחראים למתן מארח הגנה מפני פתוגנים, שמירה על שלמות מחסום המעיים, ואני יכול להפרץ בפתוגנזה של כמה מחלות. בעוד מודלים בעלי חיים יכולים לסכם כמה היבטים של המחלה, הדגם ex-vivo של enteroids נגזר מן המעי הדק בעכברים ובבני אדם מספק פלטפורמה כדי לבדוק את ההשפעות של…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG נתמך על ידי מענקים K08DK101608 ו- R03DK111473 חולים מכוני הבריאות הלאומיים, מרץ של מטבעות קרן מענק מס 5-FY17-79, הילדים גילוי מכון וושינגטון אוניברסיטת וילדים בסנט לואיס, המחלקה לרפואת ילדים בבית באוניברסיטת וושינגטון בית הספר לרפואה, סנט לואיס. האירו נתמך על-ידי R01DK104946 (PI: סילברמן), סנט לואיס לילדים ואוניברסיטת גילוי מכון וושינגטון של הילדים החולים.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
