La leche materna mejora el crecimiento de Enteroids: un modelo Ex Vivo de la proliferación celular
Summary
Este protocolo describe cómo establecer un sistema de cultivo enteroide de ratón neonatal o precoz del intestino humano así como un método eficiente para recoger la leche de ratones.
Abstract
Enteroids intestinales pequeño humanos se derivan de las criptas y cuando se cultiva en un nicho de células madre contienen todos los tipos de células epiteliales. La habilidad de establecer enteroide humanas ex vivo sistemas de cultivo son importantes Fisiopatología intestinal modelo y estudiar las respuestas celulares particulares involucrados. En los últimos años, enteroids de ratones y humanos son se cultiva, los e inclinada lejos para usarlos en varios laboratorios en todo el mundo. Esta plataforma enteroide puede utilizarse para probar los efectos de diversos tratamientos y medicamentos y qué efectos se ejercen sobre los diferentes tipos de células en el intestino. Aquí, un protocolo para el establecimiento de primaria enteroids intestinal pequeño derivados de células madre derivadas de ratones neonatales y proviene de intestino humano prematuro. Por otra parte, este sistema de cultivo enteroide fue utilizado para probar los efectos de la leche materna específica. Leche de ratón puede obtenerse eficientemente usando un extractor de leche humana modificada y leche de ratón expresa entonces puede ser utilizada para experimentos de investigación adicionales. Ahora nos demuestran los efectos de ratón expresado, humano, y leche materna de donante en el crecimiento y la proliferación de las enteroids derivadas de ratones neonatales o intestino humano prematuro.
Introduction
La enterocolitis necrotizante (NEC) es la principal causa de muerte por enfermedades gastrointestinales en los niños prematuros, que afecta a casi 1 en 10 bebés nacidos antes de las 29 semanas de gestación1,2,3. La mitad de los niños con el progreso de NEC para la forma más severa, donde la supervivencia es sólo 10-30%4,5. En los Estados Unidos, un estimado 2 billones USD al año se gastan tratando a niños con NEC6,7, sin embargo, la tasa de supervivencia ni terapia ha cambiado en los últimos 30 años. La patogenia de la NEC se caracteriza por lesiones intestinales y alteración mucosa curación8,9,10,11, sin embargo, las vías de señalización que conduce a una exacerbación respuesta inflamatoria y los mecanismos para revertir la inflamación permanecen incompleto entendidos.
La administración de leche humana se ha encontrado que la estrategia solamente protección contra NEC para recién nacidos prematuros. Previamente hemos demostrado que la leche materna protege contra el desarrollo de NEC mediante la inhibición de lo receptores inmunes innatas peaje-como el receptor 4 (TLR4) en el epitelio intestinal vía receptor del factor de crecimiento epidérmico (RFCE) señalización vía11. La suplementación de la leche materna a un fórmula experimental de NEC atenúa la respuesta inflamatoria en NEC según lo demostrado por inhibición de la apoptosis del enterocyte y restauración de la proliferación del enterocyte en una manera que depende de crecimiento epidérmico factor (EGF) y EGFR11. En otro estudio, se demostró que el nitrato, otro componente de la leche materna, contribuye a su naturaleza protectora modulando la perfusión intestinal, en comparación con fórmula infantil, que carece de nitrato y puede contribuir a la mayor frecuencia de NEC en fórmula alimentó a niños de12,13. Otros compuestos presentes en la leche materna que han demostrado para estar implicado en la protección contra el NEC son oligosacáridos de leche humana, L-arginina, glutamina y lactoferrina14,15,16, 1718,de,19. Estos elementos beneficiosos de la leche materna revelan la necesidad de su uso en la prevención de ECN, pero también subrayan la importancia de estudiar los mecanismos de señalización de vías y efectos celulares implicados en cómo la leche materna es mediar la protección contra el NEC .
En orden para otro estudio las propiedades protectoras de la leche materna en un modelo murino de NEC, hemos desarrollado una técnica novedosa, fácil de usar por que ratón puede extraerse leche materna de una presa anestesia mediante un pecho humano eléctrico bomba11,12 . Esta estrategia de adquirir leche de ratón es ventajosa, no sólo porque los extractores de leche humana son fácilmente disponibles y eficaces en la adquisición de la leche materna, sino también porque este método permite el análisis de leche de mama específicos. Como resultado, pueden comparar los efectos de la leche materna de ratón con los de la leche materna humana expresada como pasteurizada leche humana de donante de un banco de leche en modelos específicos. Esta técnica permite el estudio de los componentes de la leche materna en relación con su contribución a la prevención de NEC. Otros investigadores han desarrollado métodos de extracción de leche materna, sin embargo, estas técnicas son manuales y requieren típicamente más de un laboratorio miembro20,21,22. Aquí se presenta una técnica fácil que puede ser utilizada mediante la modificación de un extractor de leche eléctrico humano para recoger la leche de un ratón. Esta técnica puede aplicarse también a otras especies.
Para interrogar adecuadamente las vías de señalización involucradas con NEC, modelo de los sistemas es necesarios para evaluar todos los tipos de células diferentes a ser afectados en el proceso de la enfermedad. Aquí, discutimos una tal sistema modelo – enteroids – y su establecimiento del intestino humano y ratón. Enteroids intestinales humanos (HIEs) proporcionan en particular promesa significativa, ya que ofrecen un modelo humano innovador, genéticamente diversas ex vivo para ayudar en el estudio de procesos fisiopatológicos que ocurren en el tracto gastrointestinal 23. Enteroids se han encontrado para ser cultivadas a largo plazo y puede ser congelados para su posterior uso23, y a diferencia de los organoides Intestinal humano (HIOs), cuyos cultivos se desarrollan de células madre pluripotentes inducible, enteroids son generados a partir de células madre dentro de las criptas intestinales aislados24. Enteroids requieren menos mantenimiento, puede ser infectado rápidamente25y fácilmente se puede establecer desde las criptas intestinales se diferencian más que HIOs23. Por lo tanto, HIEs ofrecen muchas ventajas sobre las técnicas existentes porque puede ser desarrollados para cada región propiedades compositivas y funcionales del epitelio gastrointestinal humano23. El uso de enteroids es una opción altamente efectiva cuando se necesita un modelo humano del intestino, con apego a las limitaciones de cada región y facilidad de uso. Aquí se demuestra la técnica de aislamiento y mantenimiento de enteroids intestinal pequeño derivado de la célula de vástago primario de ratones y humanos prematuros.
Protocol
Representative Results
Discussion
El epitelio intestinal se compone de muchos subtipos celulares que son responsables de proporcionar la defensa del huésped frente a patógenos, mantener la integridad de la barrera del intestino y pueden ser violados en la patogenia de varias enfermedades. Mientras que los modelos animales pueden recapitular algunas facetas de la enfermedad, el modelo ex vivo de enteroids derivadas del intestino de los ratones y los seres humanos proporciona una plataforma para probar efectos de varios tratamientos. La importan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG es apoyado por becas K08DK101608 y R03DK111473 de los institutos nacionales de salud, marzo de Dimes Foundation Grant no. 5-FY17-79, los niños Discovery Institute de Washington University de St. Louis los niños Hospital y el Departamento de Pediatría de la Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL es apoyado por R01DK104946 (PI: Silverman), Hospital descubrimiento Institute de Washington University infantil de St. Louis los niños.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
