Latte materno aumenta la crescita di Enteroids: un modello Ex Vivo di proliferazione delle cellule
Summary
Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di cultura enteroid da mouse neonatale o prematura intestino umano così come un metodo efficace per raccogliere il latte dai topi.
Abstract
Enteroids intestinale piccolo umano sono derivate dalle cripte e quando coltivate in una nicchia staminale contengono tutti i tipi delle cellule epiteliali. La capacità di stabilire sistemi di coltura ex vivo enteroid umano sono importanti di patofisiologia intestinale di modello e di studiare il particolare risposte cellulari coinvolti. Negli ultimi anni, enteroids da topi e gli esseri umani sono in coltura, secondarie e sopraelevate distanza per un utilizzo futuro in diversi laboratori in tutto il mondo. Questa piattaforma di enteroid può essere utilizzata per testare gli effetti di vari trattamenti e farmaci e quali effetti sono esercitati sui tipi differenti delle cellule nell’intestino. Qui, un protocollo per stabilire primari derivati da cellule staminali piccolo enteroids intestinale derivato dai topi neonatali e prematuro intestino umano è fornito. Inoltre, questo sistema di coltura di enteroid è stato utilizzato per testare gli effetti del latte materno specie-specifici. Latte materno del mouse può essere ottenuto in modo efficiente utilizzando una pompa di seno umano modificate e latte espresso del mouse può essere utilizzato quindi per ulteriori esperimenti di ricerca. Ora dimostriamo gli effetti del mouse espresso, umano, e latte materno donato sulla crescita e sulla proliferazione di enteroids derivati da topi neonatali o intestino tenue umano precoce.
Introduction
Enterocolite necrotizzante (NEC) è la principale causa di morte per malattie gastrointestinali in bambini prematuri, che interessano quasi 1 in 10 neonati nati prima delle 29 settimane gestazione1,2,3. Metà degli infanti con progresso NEC per la forma più grave, dove la sopravvivenza è solo 10-30%4,5. Negli Stati Uniti, circa 2 miliardi di USD/anno sono spesi nel trattamento di neonati con NEC6,7, eppure terapia né il tasso di sopravvivenza è cambiato nel corso degli ultimi 30 anni. La patogenesi di NEC è caratterizzata dalla lesione intestinale e alterata mucosa guarigione8,9,10,11, tuttavia, le vie di segnalazione che portano a un esacerbato meccanismi per invertire l’infiammazione e la risposta infiammatoria rimangono in modo incompleto capiti.
La somministrazione di latte materno umano è stata trovata per essere la strategia solo protettiva contro NEC per bambini prematuri. Precedentemente abbiamo indicato che il latte materno protegge dallo sviluppo di NEC attraverso l’inibizione del recettore toll-like receptor immune innata 4 (TLR4) nell’epitelio intestinale attraverso il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) signaling pathway11. Il completamento del latte materno per una formula sperimentale di NEC ha attenuato la risposta infiammatoria vista in NEC come dimostrato dall’inibizione dell’apoptosi degli enterociti e restauro di proliferazione degli enterociti in un modo che era dipendente da sviluppo epidermico Factor (EGF) ed EGFR11. In un altro studio, è stato dimostrato che nitrato, un altro componente del latte materno, contribuisce alla sua natura protettiva modulando l’aspersione intestinale, rispetto al latte artificiale, che è carente di nitrato e può contribuire alla frequenza aumentata di NEC in Formula infanti alimentati12,13. Altri composti presenti nel latte materno che sono stati indicati per essere coinvolti nella protezione contro NEC includono gli oligosaccaridi del latte umano, L-arginina, glutamina e lattoferrina14,15,16, 17,18,19. Questi elementi benefici del latte materno rivelano la necessità del suo utilizzo nella prevenzione del NEC, ma anche sottolineano l’importanza di studiare i meccanismi, i percorsi e gli effetti cellulari coinvolte nel come il latte materno è mediare la protezione contro il NEC di segnalazione .
In ordine per studiare ulteriormente le proprietà protettive del latte materno in un modello murino di NEC, abbiamo sviluppato una tecnica di romanzo, facile da usare di mouse che il latte materno può essere estratta da una diga anestetizzata usando un seno umano elettrica pompa11,12 . Questa strategia di acquisizione di latte materno del mouse è vantaggiosa, non solo perché pompe del seno umano sono prontamente disponibili ed efficienti nell’approvvigionamento di latte materno, ma anche perché permette questo metodo di analisi del latte al seno specie-specifici. Di conseguenza, abbiamo possibile confrontare gli effetti del latte materno del mouse con quelle del latte materno umano espresso così come donatore umano latte pastorizzato di una banca del latte nei modelli specifici della specie. Questa tecnica consente lo studio dei componenti di latte del seno in relazione al loro contributo alla prevenzione di NEC. Altri ricercatori hanno sviluppato metodi di estrazione del latte materno, tuttavia, queste tecniche sono manuali e in genere richiedono più di un laboratorio membri20,21,22. Qui è presentata una tecnica semplice che può essere utilizzata modificando un tiralatte elettrico umano per raccogliere il latte da un mouse. Questa tecnica può essere applicata anche ad altre specie.
Per interrogare adeguatamente le vie di segnalazione coinvolte con NEC, sono necessari sistemi di modello per valutare tutti i tipi differenti delle cellule, noti per essere interessati nel processo di malattia. Qui, discutiamo uno tale sistema modello – enteroids – e della loro istituzione da mouse e intestino tenue umano. Enteroids intestinale umano (HIEs) forniscono in particolare promessa significativa, perché offrono un innovativo, geneticamente vario ex vivo modello umano per aiutare nello studio dei processi patofisiologici che avvengono nel tratto gastrointestinale 23. Enteroids sono stati trovati per essere coltivato a lungo termine e può essere congelato per più tardi uso23, e a differenza di Organoids intestinale umano (HIOs), cui culture sono sviluppate da cellule staminali pluripotenti inducibile, enteroids vengono generati da cellule staminali all’interno di cripte intestinali isolato24. Enteroids richiede meno manutenzione, può essere infettato rapidamente25e possono essere create facilmente poiché cripte intestinali sono più differenziati oltre HIOs23. Di conseguenza, HIEs offrono molti vantaggi rispetto alle tecniche esistenti perché possono essere sviluppati per esporre le proprietà specifiche dell’area compositiva e funzionale dell’ epitelio gastrointestinale umano23. L’uso di enteroids è una scelta altamente efficace quando hanno bisogno di un modello umano dell’intestino, con l’osservanza delle limitazioni di regione-specific e facilità d’uso. Qui dimostriamo la tecnica di isolare e mantenere primari derivati da cellule staminali piccolo intestinale enteroids da topi e bambini prematuri umani.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’epitelio intestinale è composto di molti sottotipi cellulari che sono responsabili per fornire la difesa ospite contro gli agenti patogeni, mantenendo l’integrità della barriera dell’intestino e possono essere violati nella patogenesi di diverse malattie. Mentre modelli animali possono ricapitolare alcuni aspetti della malattia, il modello ex vivo di enteroids derivato dall’intestino tenue dei topi e gli esseri umani fornisce una piattaforma per testare gli effetti dei vari trattamenti. Il significato del mo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG è sostenuta da sovvenzioni, K08DK101608 e R03DK111473 il National Institutes of Health, marzo Dimes Foundation Grant No. 5-FY17-79, i bambini Discovery Institute di Washington University e St. Louis Children Hospital e il dipartimento di Pediatria presso la Washington University School di medicina, St. Louis. CJL è supportato da R01DK104946 (PI: Silverman), ospedale Discovery Institute di Washington University dei bambini e St. Louis Children.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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