母乳 Enteroids の増殖を促進する: 細胞増殖のEx Vivoモデル
Summary
このプロトコルでは、新生児マウスまたはマウスから牛乳を収集する効率的な方法と同様、未熟児人間の腸から enteroid 培養系を確立する方法について説明します。
Abstract
人間の小さい腸 enteroids 陰窩から派生するため幹細胞ニッチで栽培されたすべての上皮細胞の種類が含まれています。人間 enteroid体外培養系を確立する能力がモデル腸病態に関与する特定の細胞反応を研究することが重要。近年、マウスとヒトから enteroids が培養され、継代とバンク離れていくつかの所で将来使用するため世界中。この enteroid プラットフォームは、様々 な治療法や薬の効果と異なる種類の細胞、腸内にどのような効果を発揮テストに使用することができます。ここでは、主な幹細胞由来の小さい腸 enteroids を確立するためのプロトコルが新生児マウスから派生し、未熟児人間の腸を提供します。また、この enteroid の培養システムは、種特異的な母乳の効果をテストする利用されました。変更された人間の胸ポンプを使用して効率的に取得できますマウス母乳と発現マウスの牛乳は、さらに研究実験のため使用できます。我々 は今発現マウス、人間での効果を発揮し、新生児マウスまたは未熟児人間の小腸から派生したドナーの成長および enteroids の増殖に母乳。
Introduction
壊死性腸炎 (NEC) は 29 週間妊娠1,2,3の前に生まれたほぼ 10 の 1 乳児に影響を与える、未熟児における消化管疾患による死亡の主要な原因です。NEC の進行状況、生存率はわずか 10 〜 304、5、最も深刻なフォームに児の半分。アメリカ合衆国で推定 20 億米ドル/年 NEC6、7児を扱う費やされているまだ生存率も療法は過去の 30 年にわたって変わった。NEC の病因と腸管によって特徴付けられる、悪化に導くシグナリングパス粘膜治癒8,9,10,11, しかし、障害のあります。炎症反応と逆に炎症メカニズムの不完全な理解ままです。
人間の母乳の管理は、未熟児の NEC に対してのみ保護の戦略であると発見されています。我々 は以前、母乳は、上皮成長因子受容体 (EGFR) 経路11をシグナル伝達を介して腸上皮における自然免疫受容体 toll 様受容体 4 (TLR4) の阻害により NEC 開発から保護することを示しています。実験の NEC 式に母乳の補充弱毒 NEC 上皮細胞のアポトーシスの抑制・表皮の成長に依存した方法で上皮細胞増殖修復するように見られる炎症性応答因子 (EGF) と EGFR11。別の研究で硝酸、母乳の別のコンポーネント、粉ミルク、硝酸態窒素が不足するいるとで NEC の頻度の増加に貢献するかもしれないと比較して腸の血流を調節することによりその保護、自然に貢献することが示されました。式供給幼児12,13。母乳オリゴ糖、L-アルギニン、グルタミン、ラクトフェリン14,15,16,などの NEC に対する保護に関与することが示されている母乳に存在その他化合物17,18,19。母乳のこれらの有利な要素、NEC の予防での使用の必要性を明らかにするが、また経路と細胞効果母乳は NEC に対して保護を仲介する方法に関与するシグナル伝達メカニズムを調査する重要性を強調.
マウスによって電気人間の胸ポンプ11,12 を使用して麻酔下ダムから母乳を抽出できます小説、使いやすい手法を開発 NEC のマウスモデルで母乳の保護特性の研究をする順番.マウス母乳を取得この戦略は有利、ない人間の胸ポンプは、容易に利用され、母乳の調達における効率的なだけでなくこの方法で種特異的な胸ミルク解析できるため。その結果、我々 と表現された人間の母乳のマウス母乳の効果を比較することができますと同様、種特異的なモデルにおけるミルク銀行から人間のドナー ミルクを低温殺菌します。この手法は、NEC 防止に向けての貢献に関連して乳房乳成分の研究のためことができます。他の研究者は胸ミルクの抽出方法を開発している、しかし、これらのテクニックはマニュアルとは通常 1 つ以上研究室メンバー20,21,22が必要があります。ここでマウスから牛乳を収集する人間の電気胸ポンプを変更することで利用できる簡単なテクニックが表示されます。この手法は、他の種にも適用できます。
NEC に関わるシグナル伝達経路を十分に調査、モデル システムは病気プロセスに影響を受ける知られている異なった細胞のタイプをすべて評価する必要があります。ここでは、我々 は 1 つを話し合うようなモデル システム – enteroids – とマウスおよび人間の小腸からの設立。ひと腸内 enteroids (HIEs) は、消化管で行われる病態生理学的プロセスの研究を支援するための革新的な遺伝的に多様な前のヴィヴォ人体モデルを提供するので特に重要な約束を提供します。23. 幹細胞から生成される enteroids 誘導性多能性幹細胞からの文化を開発すると、人間の腸 Organoids (HIOs) とは異なり、Enteroids 長期培養されることが判明し、以降使用23、凍ることができます。分離腸陰窩の24。Enteroids 以下のメンテナンスを必要とする、することができます感染しているすぐに25日、腸陰窩より HIOs23より区別されるので簡単に設立することができます。したがって、HIEs ひと消化管上皮23の地域固有の組成と機能特性に開発できるので既存の手法に比べて多くの利点を提供しています。Enteroids の使用は地域固有の制限事項と使いやすさの遵守、腸の人体モデルが必要なとき非常に効果的な選択です。ここで主な幹細胞由来小さい腸 enteroids マウスおよび人間の未熟児からの分離との手法を示す.
Protocol
Representative Results
Discussion
腸上皮、腸の障壁を維持、病原体に対する防御を提供するために責任がある、いくつかの疾患の病因に破られることができる多くの細胞亜型で構成されます。動物モデルは、病気のいくつかのファセットを要約することができます中、マウスとヒトの小腸から派生した enteroids の前のヴィヴォモデルは様々 な治療法の効果をテストするためのプラットフォームを提供します。Enteroid モ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG は K08DK101608 と R03DK111473 の健康の国民の協会、3 月のダイム財団助成金第 5-FY17-79、子供の発見研究所のワシントン大学、セントルイス子供病院部からの補助金によってサポートされて医学、セントルイスのワシントン大学で小児科。当行は R01DK104946 でサポートされている (PI: シルバーマン)、子供の発見研究所、ワシントン大学、セントルイス子供の病院。
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
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