मां का दूध Enteroids के विकास को बढ़ाता है: सेल प्रसार के एक पूर्व Vivo मॉडल
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे नवजात माउस या समय से पहले मानव आंत के रूप में अच्छी तरह से चूहों से दूध इकट्ठा करने के लिए एक कुशल विधि से एक enteroid संस्कृति प्रणाली स्थापित करने के लिए ।
Abstract
मानव छोटे आंत्र enteroids तहखाने से प्राप्त कर रहे है और जब एक स्टेम सेल आला में हो उपकला कोशिका प्रकार के सभी होते हैं । मानव enteroid पूर्व विवो संस्कृति प्रणालियों को स्थापित करने की क्षमता मॉडल आंत्र pathophysiology के लिए महत्वपूर्ण हैं और विशेष रूप से सेलुलर प्रतिक्रियाओं शामिल अध्ययन करने के लिए. हाल के वर्षों में, चूहों और मनुष्यों से enteroids संस्कृतिित किया जा रहा है, पारित, और दुनिया भर में कई प्रयोगशालाओं में भविष्य के उपयोग के लिए दूर बैंक । इस enteroid मंच विभिंन उपचार और दवाओं और क्या प्रभाव आंत में विभिंन कोशिका प्रकार पर लागू कर रहे है के प्रभाव का परीक्षण किया जा सकता है । यहां, प्राथमिक स्टेम सेल की स्थापना के लिए एक प्रोटोकॉल-छोटे आंतों नवजात चूहों और समय से पहले मानव आंत से व्युत्पंन enteroids व्युत्पंन प्रदान की जाती है । इसके अलावा, इस enteroid संस्कृति प्रणाली प्रजातियों के प्रभाव विशेष मां के दूध का परीक्षण करने के लिए उपयोग किया गया था । माउस स्तन दूध प्राप्त किया जा सकता है कुशलतापूर्वक एक संशोधित मानव स्तन पंप का उपयोग कर और माउस दूध व्यक्त किया तो आगे अनुसंधान प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अब हम व्यक्त माउस, मानव के प्रभाव का प्रदर्शन, और विकास और नवजात चूहों या समय से पहले मानव छोटी आंत से व्युत्पंन enteroids के प्रसार पर दाता मां के दूध ।
Introduction
नेक्रोटाइज़िंग आंत्रशोथ (परिषद) समय से पहले शिशुओं में जठरांत्र रोग से मौत का प्रमुख कारण है, लगभग 1 प्रभावित 10 शिशुओं में 29 सप्ताह के बाद पैदा हुआ1हमल,2,3। सबसे गंभीर रूप में विकास परिषद प्रगति के साथ शिशुओं के आधे, जहां अस्तित्व केवल 10-30%4, 5 है । संयुक्त राज्य अमेरिका में, एक अनुमानित 2-3 अरब अमरीकी डालर/6, 7, अभी तक न तो जीवित रहने की दर और न ही चिकित्सा पिछले 30 वर्षों में बदल गया है के साथ शिशुओं का इलाज खर्च कर रहे हैं । विकास परिषद के रोगजनन आंत्र चोट और बिगड़ा श्लैष्मिक हीलिंग8,9,10,11, तथापि, सिग्नलिंग मार्ग एक गहरा करने के लिए अग्रणी की विशेषता है भड़काऊ प्रतिक्रिया और तंत्र सूजन रिवर्स करने के लिए पूरी तरह से समझ में रहते हैं ।
मानव स्तन दूध के प्रशासन के लिए समय से पहले शिशुओं के लिए परिषद के खिलाफ ही सुरक्षात्मक रणनीति हो पाया गया है । हम पहले से पता चला है कि स्तन के दूध जंमजात प्रतिरक्षा रिसेप्टर टोल के निषेध के माध्यम से विकास परिषद के खिलाफ की रक्षा-रिसेप्टर 4 की तरह (TLR4) आंत्र उपकला में एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर के माध्यम से (EGFR) मार्ग11संकेतन. एक प्रयोगात्मक परिषद सूत्र को स्तन के दूध की पूरकता के रूप में enterocyte apoptosis और enterocyte प्रसार की बहाली के निषेध द्वारा प्रदर्शन के रूप में परिषद में देखा भड़काऊ प्रतिक्रिया तनु एक तरह से है कि एपिडर्मल विकास पर निर्भर था भाज्या (EGF) आणि EGFR११. एक अन्य अध्ययन में, यह दिखाया गया है कि नाइट्रेट, स्तन के दूध का एक और घटक, आंत्र छिड़काव संग्राहक द्वारा अपने सुरक्षात्मक प्रकृति के लिए योगदान देता है, के रूप में शिशु फार्मूला है, जो नाइट्रेट की कमी है की तुलना में और पूर्वोत्तर क्षेत्र में वृद्धि की आवृत्ति में योगदान कर सकते हैं फार्मूला फेड शिशुओं12,13। अंय मां के दूध में मौजूद यौगिकों कि विकास परिषद के खिलाफ संरक्षण में शामिल होना दिखाया गया है मानव दूध oligosaccharides, एल arginine, glutamine, और लैक्टोफेरिन14,15,16, 17,18,19. मां के दूध के इन लाभकारी तत्वों विकास परिषद की रोकथाम में इसके उपयोग की आवश्यकता का पता चलता है, लेकिन यह भी तंत्र का अध्ययन करने के महत्व पर जोर, रास्ते संकेत, और सेलुलर कैसे स्तन दूध में शामिल प्रभाव विकास परिषद के खिलाफ संरक्षण मध्यस्थता है .
आदेश में आगे विकास परिषद के एक माउस मॉडल में स्तन के दूध के सुरक्षात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए, हम एक उपंयास, प्रयोग करने में आसान तकनीक है जिसके द्वारा माउस मां के दूध एक anesthetized बांध से एक इलेक्ट्रिक मानव स्तन पंप का उपयोग कर निकाला जा सकता है11,12 . माउस स्तन दूध प्राप्त करने की यह रणनीति लाभप्रद है, न केवल क्योंकि मानव स्तन पंप आसानी से उपलब्ध है और मां के दूध की खरीद में कुशल हैं, बल्कि इसलिए भी कि इस विधि प्रजातियों के लिए अनुमति देता है विशेष स्तन दूध विश्लेषण । एक परिणाम के रूप में, हम मानव मां के दूध के साथ ही pasteurized मानव दाता दूध प्रजातियों में एक दूध बैंक से विशेष मॉडल के उन व्यक्त के साथ माउस मां के दूध के प्रभाव की तुलना कर सकते हैं । इस तकनीक को परिषद की रोकथाम की दिशा में उनके योगदान के संबंध में स्तन के दूध घटकों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है । अंय जांचकर्ताओं स्तन दूध निष्कर्षण तरीकों विकसित किया है, तथापि, इन तकनीकों मैनुअल और आम तौर पर एक से अधिक प्रयोगशाला सदस्य20,21,22की आवश्यकता होती है । यहां एक आसान तकनीक है कि एक मानव इलेक्ट्रिक स्तन पंप को संशोधित करने के लिए एक माउस से दूध एकत्र द्वारा उपयोग किया जा सकता है प्रस्तुत किया है । इस तकनीक को अन्य प्रजातियों में भी लागू किया जा सकता है ।
पर्याप्त रूप से संकेतन परिषद के साथ शामिल रास्ते पूछताछ करने के लिए, मॉडल सिस्टम के लिए विभिंन प्रकार के कोशिका के सभी मूल्यांकन की जरूरत है रोग की प्रक्रिया में प्रभावित हो जाना । यहां, हम एक ऐसी मॉडल प्रणाली-enteroids-और माउस और मानव छोटी आंत से उनकी स्थापना पर चर्चा । मानव आंत्र enteroids (HIEs) विशेष रूप से महत्वपूर्ण वादा प्रदान करते हैं, क्योंकि वे एक अभिनव प्रदान करते हैं, आनुवंशिक रूप से विविध पूर्व vivo मानव मॉडल pathophysiological प्रक्रियाओं है कि जठरांत्र संबंधी मार्ग में जगह लेने के अध्ययन में सहायता करने के लिए 23. Enteroids को लंबे समय तक प्रसंस्कृत होना पाया गया है और बाद में उपयोग के लिए जम सकता है23, और विपरीत मानव आंत्र Organoids (HIOs), जिनकी संस्कृतियों inducible pluripotent स्टेम कोशिकाओं से विकसित कर रहे हैं, Enteroids स्टेम कोशिकाओं से उत्पन्न कर रहे हैं अलग आंत्र तहखाने के भीतर24। Enteroids कम रखरखाव की आवश्यकता है, जल्दी से संक्रमित किया जा सकता है25, और आसानी से स्थापित किया जा सकता है के बाद से आंत्र तहखाना अधिक HIOs23से विभेदित कर रहे हैं । इसलिए, HIEs मौजूदा तकनीक पर कई लाभ प्रदान करते हैं, क्योंकि वे क्षेत्र के प्रदर्शन के लिए विकसित किया जा सकता है विशेष संरचना और मानव जठरांत्र उपकला के कार्यात्मक गुण23. enteroids का उपयोग एक अत्यंत प्रभावी विकल्प है जब आंत के एक मानव मॉडल की जरूरत है, क्षेत्र के पालन के साथ-विशिष्ट सीमाओं और आसानी से उपयोग । यहां हम अलग और प्राथमिक स्टेम सेल को बनाए रखने की तकनीक का प्रदर्शन-चूहों और समय से पहले मानव शिशुओं से छोटे आंत्र enteroids व्युत्पंन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
आंतों उपकला कई सेलुलर उपप्रकार है कि रोगज़नक़ों के खिलाफ मेजबान रक्षा प्रदान करने के लिए जिंमेदार हैं शामिल है, आंत बाधा अखंडता को बनाए रखने, और कई रोगों के रोगजनन में उल्लंघन किया जा सकता है । जबकि पशु ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
एमजी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान K08DK101608 और R03DK111473 द्वारा समर्थित है, सिक्का की मार्च फाउंडेशन अनुदान No .5-FY17-79, वाशिंगटन विश्वविद्यालय के बच्चों की खोज संस्थान और सेंट लुइस बच्चों के अस्पताल और विभाग के वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन, सेंट लुइस में बाल रोग । CJL R01DK104946 (PI: Silverman), वाशिंगटन विश्वविद्यालय और सेंट लुइस बच्चों के अस्पताल के बच्चों की खोज संस्थान द्वारा समर्थित है ।
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
