Morsmelk forbedrer veksten av Enteroids: en Ex Vivo modell av celle spredning
Summary
Denne protokollen beskriver hvordan du oppretter en enteroid kultur-systemet fra neonatal mus eller tidlig menneskelige tarmen samt effektiv metode å samle melk fra mus.
Abstract
Menneskelige liten intestinal enteroids er avledet fra krypten og når dyrket i en stilk cellen nisje inneholder alle tarmepitelet. Muligheten til å etablere menneskelige enteroid ex vivo kultur systemer er viktig modell intestinal patofysiologi og studere bestemt mobilnettet svarene involvert. De siste årene, er enteroids fra mus og mennesker blir kultivert, passaged og banked bort for fremtidig bruk i flere laboratorier over hele verden. Denne enteroid-plattformen kan brukes til å teste effekten av ulike behandlinger og medisiner og hvilke effekter er legges på ulike celletyper i tarmen. Her en protokoll for å etablere primære Stamcelle-avledet liten intestinal enteroids avledet fra neonatal mus og tidlig menneskelige tarmen er gitt. Dessuten, denne enteroid kultur-systemet ble benyttet for å teste effekten av artsspesifikke morsmelk. Musen morsmelk kan fås effektivt ved hjelp av en modifisert menneskelig brystpumpe og uttrykte musen melk kan brukes for videre forskning eksperimenter. Vi nå viser effekten av uttrykt mus, menneskelig, og donor morsmelk på vekst og spredning av enteroids avledet fra neonatal mus eller tidlig menneskelige tynntarmen.
Introduction
Nekrotiserende enterokolitt er (NEC) den ledende dødsårsaken fra gastrointestinal sykdom i premature barn, påvirker nesten 1 av 10 barn født før 29 uker svangerskapet1,2,3. Halvparten av spedbarn NEC fremdrift til alvorligste skjemaet hvor overlevelse er bare 10-30%4,5. I USA, en anslagsvis 2-3 milliarder dollar/år er brukt til å behandle spedbarn med NEC6,7, men verken overlevelse eller terapi har endret seg over de siste 30 årene. Patogenesen av NEC er preget av intestinal skade og svekket mucosal healing8,9,10,11, men signalveier fører til en forsterket inflammatorisk respons og mekanismer for å reversere betennelse fortsatt ufullstendig forstått.
Administrasjon av morsmelk er funnet for å være bare beskyttende strategien mot NEC for premature barn. Vi har tidligere vist at morsmelk beskytter mot NEC utvikling gjennom hemming av den medfødte immunsystemet reseptor toll-like reseptoren 4 (TLR4) i intestinal epitel via epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalering veien11. Tilskudd av brystmelk til en eksperimentell NEC formel dempes betennelsesreaksjon i NEC som demonstrert av hemming av enterocyte apoptose og restaurering av enterocyte spredning på en måte som var avhengig av epidermal vekst faktor (EGF) og EGFR11. I en annen studie, ble det vist som nitrate, en annen komponent i morsmelk, bidrar til sin beskyttende natur av modulerende intestinal perfusjon, i forhold til morsmelkerstatning, som mangler nitrat og kan bidra til den økte frekvensen av NEC i formelen matet spedbarn12,13. Andre forbindelser i morsmelk som har vist seg å være involvert i beskyttelse mot NEC inkluderer morsmelk oligosaccharides, L-arginin, glutamin og Laktoferrin14,15,16, 17,18,19. Disse gunstige elementer av brystmelk avsløre nødvendigheten av dens bruk i forebygging av NEC, men også vekt på å studere mekanismer, signalisering pathways og cellular effekter involvert på hvordan morsmelk er formidling av beskyttelse mot NEC .
For videre studier av beskyttende egenskaper av brystmelk i en musemodell av NEC, vi utviklet en roman, brukervennlig teknikk av hvilke musen morsmelk kan hentes fra en bedøvet dam ved hjelp av en elektrisk menneskelig bryst pumpe11,12 . Denne strategien for musen morsmelk er fordelaktig, ikke bare fordi menneskelig brystpumper er lett tilgjengelig og effektiv i innkjøp av morsmelk, men også fordi denne metoden tillater artsspesifikke bryst melk analyser. Som et resultat vi kan sammenligne effekten av musen morsmelk med de uttrykte morsmelk som pasteurisert menneskelige donor melk fra melk bank i artsspesifikke modeller. Denne teknikken tillater for studier av bryst melk komponenter i forhold til deres bidrag til NEC forebygging. Andre etterforskere har utviklet bryst melk utvinning metoder, men disse teknikkene er manuelle og vanligvis krever flere lab medlem20,21,22. Her vises en enkel teknikk som kan benyttes ved å endre en menneskelig elektrisk brystpumpe å samle melk fra en mus. Denne teknikken kan også brukes til andre arter.
For å tilstrekkelig avhøre signalveier involvert med NEC, for modellere systemer å vurdere alle de ulike celletyper kjent påvirkes i sykdommen prosessen. Her diskuterer vi en slik modellsystem – enteroids- og sin etablering fra mus og menneskelige tynntarmen. Menneskelige intestinal enteroids (HIEs) gi spesielt betydelig løfte, fordi de tilbyr en nyskapende, genetisk ulike ex vivo menneskelige modellen som hjelp til å studere patofysiologiske prosesser som finner sted i fordøyelsessystemet 23. Enteroids har blitt funnet for å kultivert langsiktig og kan fryses for senere bruk23, og i motsetning til menneskelige Intestinal Organoids (HIOs), der kulturer er utviklet fra induserbart pluripotent stamceller, enteroids genereres fra stamceller i isolerte intestinal Krypter24. Enteroids krever mindre vedlikehold, kan være infisert raskt25, og kan etableres lett siden intestinal crypts er mer forskjelligartet enn HIOs23. Derfor tilbyr HIEs mange fordeler over eksisterende teknikkene fordi de kan være utviklet for å viser områdespesifikk komposisjonelle og funksjonelle egenskapene i den menneskelige mage epitel23. Bruk av enteroids er en svært effektiv valg når behov for en menneskelig modell av tarmen, med tilslutning til region-spesifikke begrensninger og lette-av-bruk. Her viser vi teknikken for isolering og opprettholde primære Stamcelle-avledet liten intestinal enteroids fra mus og tidlig menneskelige spedbarn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Intestinal epitel består av mange mobilnettet undertypene som er ansvarlig for å gi vert forsvar mot patogener, opprettholde gut barriere integritet, og kan være brutt i patogenesen av flere sykdommer. Mens dyremodeller kan recapitulate noen fasetter av sykdommen, gir ex vivo modell av enteroids fra hele tynntarmen av mus og mennesker en plattform for å teste effekten av ulike behandlinger. Betydningen av enteroid modellen kan forskere kultur og differensiere intestinal stamceller i epithelial mobilnettet un…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MG støttes av gir K08DK101608 og R03DK111473 fra den National Institutes of Health, mars av Dimes Foundation Grant nr 5-FY17-79, Children’s Discovery Institute of Washington University og St. Louis Children’s Hospital og departementet Pediatri ved Washington University School of Medicine, St. Louis. CJL støttes av R01DK104946 (PI: Silverman), Children’s Discovery Institute of Washington University og St. Louis barns sykehus.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) with 4.5 g/L Glucose and L-Glutamine | Lonza | 12-604F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 26140-079 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Humulin N (Insulin) | Eli Lilly And Company | 0002-8315 | |
| 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Gentamicin | Gibco | 15750-060 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | |
| 0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0 | Invitrogen | 15575-020 | |
| 1x Advanced DMEM/F-12 | Invitrogen | 12634-028 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | 25030-081 | |
| 1 M N-2-Hydroxyethylpiperazine-N-2-Ethane Sulfonic Acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3537 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| 100x N-2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| 50x B-27 Supplement Minus Vitamin A | Gibco | 08-0085SA | |
| 100x ROCK Inhibitor Y-27632, Dihydrochloride | Sigma-Aldrich | Y0503 | |
| Recombinant Mouse Wnt3a Protein | R&D Systems | 1324-WN | |
| Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recombinant Mouse R-Spondin 1 | R&D Systems | 3474-RS | |
| Recombinant Murine Epidermal Growth Factor (EGF) | PeproTech | 315-09 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix | Corning | 356231 | |
| 35 x 10 mm Cell Culture Petri Dish | Eppendorf | 0030700112 | |
| 24-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030722116 | |
| 48-Well Cell Culture Plate | Eppendorf | 0030723112 | |
| 8-Well Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 154534 | |
| 50 mL Conical Tube | Corning | 352070 | |
| 100 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-549 | |
| 70 μM Sterile Cell Strainer | Fisher Scientific | 22-363-548 | |
| 1x Phosphate-Buffered Saline (PBS), pH 7.2 | Invitrogen | 20012-027 | |
| 16% Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-544-D | |
| Confocal Microscope Leica TCS SP8 X | Leica Microsystems | N/A | |
| Photoshop CS6 | Adobe Systems | N/A | |
| 18 G 1.5 Inch Needle | Becton Dickinson | 305196 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich | 792632 | |
| Oxytocin | Sigma-Aldrich | O3251 | |
| Human Double Electric Breast Pump | Lansinoh | 044677530163 | |
| 5 mL Round Bottom Test Tube | Corning | 352058 | |
| Rubber Stoppers | Frey Scientific | 560761 | |
| Ki67 Antibody | Abcam | AB15580 | |
| Human Mki67 primer F: 5'-GACCTCAAACTGGCTCCTAATC-3' R: 5'-GCTGCCAGATAGAGTCAGAAAG-3' | Integrated DNA Technologies | N/A |
References
- Patel, R. M., Denning, P. W. Therapeutic use of prebiotics, probiotics, and postbiotics to prevent necrotizing enterocolitis: what is the current evidence?. Clin Perinatol. 40 (1), 11-25 (2013).
- Caplan, M. S., Jilling, T. New concepts in necrotizing enterocolitis. Curr Opin Pediatr. 13 (2), 111-115 (2001).
- Henry, M. C., Moss, R. L. Necrotizing enterocolitis. Annu Rev Med. 60, 111-124 (2009).
- Lin, P. W., Stoll, B. J. Necrotising enterocolitis. Lancet. 368 (9543), 1271-1283 (2006).
- Neu, J., Walker, W. A. Necrotizing enterocolitis. N Engl J Med. 364 (3), 255-264 (2011).
- Bartick, M., Reinhold, A. The burden of suboptimal breastfeeding in the United States: a pediatric cost analysis. Pediatrics. 125 (5), e1048-e1056 (2010).
- Bisquera, J. A., Cooper, T. R., Berseth, C. L. Impact of necrotizing enterocolitis on length of stay and hospital charges in very low birth weight infants. Pediatrics. 109 (3), 423-428 (2002).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Gribar, S. C., et al. Reciprocal expression and signaling of TLR4 and TLR9 in the pathogenesis and treatment of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 182 (1), 636-646 (2009).
- Good, M., et al. Amniotic fluid inhibits Toll-like receptor 4 signaling in the fetal and neonatal intestinal epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (28), 11330-11335 (2012).
- Good, M., et al. Breast milk protects against the development of necrotizing enterocolitis through inhibition of Toll-like receptor 4 in the intestinal epithelium via activation of the epidermal growth factor receptor. Mucosal Immunol. 8 (5), 1166-1179 (2015).
- Yazji, I., et al. Endothelial TLR4 activation impairs intestinal microcirculatory perfusion in necrotizing enterocolitis via eNOS-NO-nitrite signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Lundberg, J. O., Weitzberg, E., Gladwin, M. T. The nitrate-nitrite-nitric oxide pathway in physiology and therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 7 (2), 156-167 (2008).
- Bober-Olesinska, K., Kornacka, M. K. Effects of glutamine supplemented parenteral nutrition on the incidence of necrotizing enterocolitis, nosocomial sepsis and length of hospital stay in very low birth weight infants. Med Wieku Rozwoj. 9 (3 Pt 1), 325-333 (2005).
- Li, N., et al. Glutamine decreases lipopolysaccharide-induced intestinal inflammation in infant rats. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 286 (6), G914-G921 (2004).
- Good, M., et al. The human milk oligosaccharide 2′-fucosyllactose attenuates the severity of experimental necrotising enterocolitis by enhancing mesenteric perfusion in the neonatal intestine. Br J Nutr. 116 (7), 1175-1187 (2016).
- Jantscher-Krenn, E., et al. The human milk oligosaccharide disialyllacto-N-tetraose prevents necrotising enterocolitis in neonatal rats. Gut. 61 (10), 1417-1425 (2012).
- Akin, I. M., et al. Oral lactoferrin to prevent nosocomial sepsis and necrotizing enterocolitis of premature neonates and effect on T-regulatory cells. Am J Perinatol. 31 (12), 1111-1120 (2014).
- Amin, H. J., et al. Arginine supplementation prevents necrotizing enterocolitis in the premature infant. J Pediatr. 140 (4), 425-431 (2002).
- Rodgers, C. T. Practical aspects of milk collection in the rat. Lab Anim. 29 (4), 450-455 (1995).
- DePeters, E. J., Hovey, R. C. Methods for collecting milk from mice. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 14 (4), 397-400 (2009).
- Willingham, K., et al. Milk collection methods for mice and Reeves’ muntjac deer. J Vis Exp. (89), (2014).
- Saxena, K., et al. Human Intestinal Enteroids: a New Model To Study Human Rotavirus Infection, Host Restriction, and Pathophysiology. J Virol. 90 (1), 43-56 (2015).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. J Biol Chem. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Drummond, C. G., et al. Enteroviruses infect human enteroids and induce antiviral signaling in a cell lineage-specific manner. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (7), 1672-1677 (2017).
- Ettayebi, K., et al. Replication of human noroviruses in stem cell-derived human enteroids. Science. 353 (6306), 1387-1393 (2016).
