Ricostituzione delle proteine di membrana
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Panoramica
La ricostituzione è il processo di ritorno di una biomolecola isolata alla sua forma o funzione originale. Ciò è particolarmente utile per lo studio delle proteine di membrana, che consentono importanti funzioni cellulari e influenzano il comportamento dei lipidi vicini. Per studiare la funzione delle proteine di membrana purificate in situ, devono essere ricostituite integrandole in una membrana lipidica artificiale.
Questo video introduce i concetti di ricostituzione delle proteine di membrana e le procedure correlate, come l’isolamento proteico con detergente, la formazione di vescicole artificiali utilizzando lipidi, l’incorporazione della proteina isolata nella vescicola artificiale e la separazione del detergente dalla soluzione. Infine, vengono trattate due applicazioni: la ricostituzione delle proteine di trasporto di membrana e la ricostituzione delle proteine di raccolta della luce.
La ricostituzione è il processo di ripristino di una biomolecola isolata alla sua forma o funzionalità originale. Questo approccio viene spesso utilizzato quando si studiano le proteine di membrana, che consentono molti importanti processi cellulari e influenzano il comportamento dei lipidi vicini. Tuttavia, la complessità dell’ambiente cellulare rende le funzioni proteiche di membrana difficili da studiare in situ. Le proteine possono essere estratte e purificate, ma le loro effettive funzioni non possono essere valutate senza una membrana. Pertanto, le proteine di membrana isolate vengono ricostituite mediante integrazione in una membrana lipidica artificiale, come un liposoma. Questo video introdurrà i principi della ricostituzione delle proteine di membrana, una procedura di ricostituzione generale e alcune applicazioni in biochimica.
Le membrane cellulari sono costituite principalmente da fosfolipidi e proteine di membrana. I fosfolipidi formano un doppio strato in cui le teste di fosfato idrofilo interagiscono con l’interno e l’esterno acquoso della cellula, mentre le code di acidi grassi idrofobi interagiscono tra loro nel doppio strato.
Alcune proteine di membrana interagiscono con la membrana solo per interazioni elettrostatiche o non covalenti. Altre, chiamate “proteine integrali”, sono incorporate nel doppio strato lipidico.
Come il doppio strato, le proteine integrali hanno estremità idrofile e un centro idrofobo e sono mantenute in posizione da interazioni idrofobiche. Le proteine integrali che coprono l’intera membrana sono conosciute come “proteine transmembrana”.
Le interazioni tra queste proteine e la membrana sono così forti che anche la lisi delle cellule non le separerà. Un tensioattivo speciale chiamato detergente viene utilizzato per estrarre le proteine. Simili ai fosfolipidi, i detergenti hanno teste idrofile e code lipofile e possono entrare liberamente nella membrana.
All’interno della membrana, le code lipofile del detergente interagiscono con il nucleo proteico idrofobo. Questo circonda la proteina con un guscio delle teste detergenti idrofile, che interrompe le interazioni proteina-lipidi.
Il complesso proteina-detergente è ora facilmente separato dalla membrana. Il detergente rende il complesso solubile in soluzioni acquose e pronto per la ricostituzione in una membrana artificiale.
Le proteine sono spesso ricostituite nelle membrane dei liposomi, che sono vescicole artificiali. Per preparare i liposomi, i lipidi secchi vengono idratati e agitati per indurre la formazione di vescicole. Quando viene aggiunto un detergente, viene incorporato nelle membrane liposomiche.
Per ricostituire la proteina, le proteine solubilizzate e i liposomi vengono combinati, quindi il detergente viene rimosso dalla soluzione mediante dialisi o adsorbimento chimico. Le proteine e i liposomi si assemblano rapidamente in proteolipolismi, quindi solo i gruppi idrofili sono esposti. Le proteine quindi funzionano come farebbero in una membrana cellulare e possono essere studiate in isolamento.
Ora che abbiamo trattato le basi della ricostituzione proteica, esaminiamo un protocollo per ricostituire le proteine di membrana nei liposomi.
Per iniziare a isolare le proteine di membrana, le cellule vengono lysed. Le cellule ininterrotte vengono rimosse con la centrifugazione.
Il surnatante viene centrifugato ad una velocità maggiore per pellettizzare le membrane. Il pellet viene ri-sospeso e viene aggiunto un detergente per estrarre le proteine.
I detriti cellulari rimanenti vengono rimossi mediante centrifugazione aggiuntiva. La proteina viene purificata dal surnatante con cromatografia su colonna e quindi concentrata o purificata ulteriormente secondo necessità.
Per iniziare a preparare i liposomi, una sospensione di fosfolipidi in solvente organico viene essiccata sotto azoto o argon.
I fosfolipidi sono idratati con tampone idratante e la miscela viene sonicata per finire di creare i liposomi.
Il detergente viene aggiunto per solubilizzare i liposomi, che viene poi combinato con le proteine.
Il detergente viene quindi rimosso mediante adsorbimento su perline di polistirolo, dialisi o una colonna legante il detergente. I proteolipolisi risultanti sono pronti per essere purificati e utilizzati in esperimenti successivi.
Ora che hai familiarità con le basi di una procedura di ricostituzione proteica di membrana, diamo un’occhiata ad alcune applicazioni della ricostituzione proteica in biochimica.
Una proteina di trasporto di membrana è stata ricostituita per ottenere una comprensione più chiara del suo meccanismo di trasporto. La sua funzione post-ricostituzione è stata verificata con un efflusso di ioni ioduro. Successivamente, l’attività di trasporto è stata studiata in presenza di vari inibitori e potenziatori del canale ionico di piccole molecole. In questo modo, si potrebbero studiare le interazioni dirette di queste piccole molecole con la proteina di trasporto.
Le proteine di membrana che legano la clorofilla e i carotenoidi nelle piante raccolgono la luce, promuovono la separazione della carica e mitigano i danni alla luce. Ricostituendo queste proteine che raccolgono la luce, è possibile studiare la loro dinamica di ripiegamento e l’interazione con i pigmenti. Le proteine di raccolta della luce ricostituite con questa tecnica avevano proprietà ottiche molto simili alle proteine native. La spettroscopia di emissione di fluorescenza può quindi essere utilizzata per studiare il trasferimento di energia dai pigmenti alle proteine ricostituite per la raccolta della luce.
Hai appena visto il video di JoVE sulla ricostituzione delle proteine di membrana. La ricostituzione è un modo per trasferire proteine importanti a una cellula mimica per ulteriori indagini. Questo video ha coperto i principi della ricostituzione proteica, un protocollo di ricostituzione e alcune applicazioni in biochimica. Grazie per l’attenzione!
Procedura
Divulgazioni
Trascrizione
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
