Reconstitución de proteínas de membrana
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Panoramica
Reconstitución es el proceso de volver una biomolécula aislado a su forma o su función original. Esto es particularmente útil para el estudio de proteínas de la membrana, que permiten funciones celulares importantes y afectan el comportamiento de los lípidos cercano. Para estudiar la función purificada de proteínas de membrana in situ, debe ser reconstituidos por integrarlos en una membrana lipídica artificial.
Este video presenta la membrana proteína reconstitución conceptos y procedimientos relacionados, tales como aislamiento de proteínas con detergente, formación de vesículas artificiales con lípidos, incorporación de la proteína aislada en la vesícula artificial y separación del detergente de la solución. Por último, se cubren dos aplicaciones: reconstitución de proteínas de transporte de membrana y la reconstitución de proteínas recolección de luz.
Reconstitución es el proceso de restauración de una biomolécula aislado a su forma original o su funcionalidad. A menudo se utiliza este enfoque al estudio de proteínas de la membrana, que permiten muchos procesos celulares importantes y afectan el comportamiento de los vecinos de lípidos. Sin embargo, la complejidad del entorno celular dificulta la membrana funciones de la proteína a estudiar en situ. Las proteínas pueden extraerse y purificarse, pero sus funciones reales no pueden ser evaluados sin una membrana. Por lo tanto, las proteínas de membrana aislado son reconstituidos por integración en una membrana lipídica artificial, como un liposoma. Este video presenta los principios de la reconstitución de proteínas de membrana, un procedimiento de reconstitución general y unas cuantas aplicaciones en bioquímica.
Las membranas celulares consisten principalmente de fosfolípidos y proteínas de membrana. Los fosfolípidos forman una bicapa en la que las cabezas hidrofílicas de fosfato interactúan con el acuoso interior y exterior de la célula, mientras que las colas de ácidos grasos hidrofóbicos interactúan entre sí en la bicapa.
Algunas proteínas de la membrana sólo interactúan con la membrana por interacciones electrostáticas o no covalente. Otros, llamados ‘proteínas integradas’, se incrustan en la bicapa lipídica.
Como la bicapa proteínas integrales tienen extremos hidrofílicos y un centro hidrofóbico y se llevan a cabo en lugar por interacciones hidrofóbicas. Las proteínas integrales que abarcan la membrana entera se conocen como “proteínas transmembranales”.
Las interacciones entre la membrana y estas proteínas son tan fuertes que incluso lisis de las células a no separarlos. Un surfactante especial llamado un detergente se utiliza para extraer las proteínas. Similar a los fosfolípidos, detergentes tienen cabezas hidrofílicas y colas lipofílicas y pueden entrar libremente en la membrana.
Dentro de la membrana, las colas lipofílicas del detergente interactúan con el núcleo hidrofóbico de la proteína. Esto rodea la proteína con una concha de las cabezas hidrofílicas de detergente, que interrumpen las interacciones proteína-lípido.
El complejo proteína-detergente ahora se separa fácilmente de la membrana. El detergente hace el complejo soluble en soluciones acuosas y listos para su reconstitución en una membrana artificial.
A menudo se reconstituyen las proteínas en las membranas de liposomas, que son vesículas artificiales. Para preparar liposomas, lípidos secados hidratados y agitados para inducir la formación de la vesícula. Cuando un detergente se agrega, se incorpora a las membranas de liposomas.
Para reconstituir la proteína, se combinan las proteínas solubilizadas y liposomas, y luego se elimina el detergente de la solución por diálisis o adsorción química. Las proteínas y liposomas rápidamente montan en proteoliposomes, tan sólo los grupos hidrofílicos están expuestos. Las proteínas funcionan entonces como en una membrana de la célula y puede ser investigados de manera aislada.
Ahora que hemos cubierto los fundamentos de la reconstitución de proteínas, vamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de la membrana en los liposomas.
Para comenzar a aislar las proteínas de membrana, las células son sometidas a lisis. Las células intactas se quitan con centrifugación.
El sobrenadante es centrifugado a una velocidad superior a las membranas de la pelotilla. El sedimento se suspende de nuevo y se añade un detergente para extraer las proteínas.
Los restos de células restantes se elimina por centrifugación adicional. La proteína es purificada del sobrenadante con cromatografía en columna y luego concentrada o purificada aún más según sea necesario.
Para comenzar a preparar los liposomas, una suspensión de fosfolípidos en solvente orgánico se seca bajo nitrógeno o argón.
Los fosfolípidos son hidratados con tampón de hidratación, y la mezcla se sonicó para terminar la creación de los liposomas.
Detergente se agrega para solubilizar los liposomas, que se combina con las proteínas.
El detergente se elimina luego por adsorción sobre granos del poliestireno, diálisis o de una columna de enlace de detergente. El proteoliposomes resultantes está listos para ser purificada y utilizada en experimentos posteriores.
Ahora que usted está familiarizado con los fundamentos de un procedimiento de reconstitución de proteínas de membrana, echemos un vistazo a algunas aplicaciones de la reconstitución de proteínas en bioquímica.
Una proteína transportadora de membrana se reconstituyó para obtener una comprensión más clara de su mecanismo de transporte. Su reconstitución después de la función se verificó con un eflujo de iones yoduro. Luego, se estudió la actividad de transporte en presencia de diferentes inhibidores de molécula pequeña ion channel y potenciadotes. De esta manera, podrían estudiarse las interacciones directas de estas pequeñas moléculas con la proteína de transporte.
Clorofila y carotenoides-proteínas de membrana en plantas cosechan luz, promoción la separación del cargo y mitigación daños ligeros. Por reconstituir estas proteínas de recolección de luz, se pueden estudiar su dinámica y la interacción con pigmentos plegable. Las proteínas de recolección de luz reconstituidas con esta técnica tenían propiedades ópticas muy similares a las proteínas nativas. Espectroscopia de emisión de fluorescencia puede utilizarse entonces para estudiar la transferencia de energía de los pigmentos a las proteínas reconstituidas de recolección de luz.
Sólo has visto video de Zeus durante la reconstitución de proteínas de membrana. Reconstitución es una manera de transferir proteínas importantes para un imitador de celda para análisis adicionales. Este video cubre los principios de la reconstitución de proteínas, un protocolo de reconstitución y unas cuantas aplicaciones en bioquímica. ¡Gracias por ver!
Procedura
Divulgazioni
Trascrizione
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
