Reconstituição de Proteínas de Membrana
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Panoramica
Reconstituição é o processo de devolução de uma biomolécula isolada à sua forma ou função original. Isso é particularmente útil para estudar proteínas de membrana, que permitem funções celulares importantes e afetam o comportamento de lipídios próximos. Para estudar a função das proteínas de membrana purificadas in situ, elas devem ser reconstituídas integrando-as em uma membrana lipídica artificial.
Este vídeo introduz conceitos de reconstituição de proteínas de membrana e procedimentos relacionados, como isolamento de proteínas utilizando detergente, formação de vesículas artificiais utilizando lipídios, incorporação da proteína isolada na vesícula artificial e separação do detergente da solução. Por fim, duas aplicações são cobertas: a reconstituição de proteínas de transporte de membranas e a reconstituição de proteínas de colheita de luz.
Reconstituição é o processo de restauração de uma biomolécula isolada à sua forma ou funcionalidade original. Essa abordagem é frequentemente utilizada no estudo de proteínas de membrana, que permitem muitos processos celulares importantes e afetam o comportamento dos lipídios vizinhos. No entanto, a complexidade do ambiente celular torna as funções da proteína da membrana difíceis de estudar in situ. As proteínas podem ser extraídas e purificadas, mas suas funções reais não podem ser avaliadas sem uma membrana. Portanto, proteínas isoladas de membrana são reconstituídas pela integração em uma membrana lipídica artificial, como um lipossomo. Este vídeo introduzirá os princípios da reconstituição da proteína da membrana, um procedimento geral de reconstituição e algumas aplicações na bioquímica.
As membranas celulares consistem principalmente em fosfolipídios e proteínas de membrana. Os fosfolipídios formam uma bicamada na qual as cabeças de fosfato hidrofílico interagem com o interior aquoso e exterior da célula, enquanto as caudas de ácido graxo hidrofóbico interagem entre si na bicamada.
Algumas proteínas de membrana só interagem com a membrana por interações eletrostáticas ou não covalentes. Outros, chamados de “proteínas integrais”, estão incorporados na bicamadas lipídica.
Assim como a bicamadas, as proteínas integrais têm extremidades hidrofílicas e um centro hidrofóbico, e são mantidas no lugar por interações hidrofóbicas. Proteínas integrais que abrangem toda a membrana são conhecidas como “proteínas transmembranas”.
As interações entre essas proteínas e a membrana são tão fortes que mesmo a lise das células não as separará. Um surfactante especial chamado detergente é usado para extrair as proteínas. Semelhante aos fosfolipídios, os detergentes têm cabeças hidrofílicas e caudas lipofílicas, e podem entrar na membrana livremente.
Dentro da membrana, as caudas lipofílicas do detergente interagem com o núcleo de proteína hidrofóbica. Isso envolve a proteína com uma casca das cabeças de detergente hidrofílico, o que interrompe as interações proteína-lipídicas.
O complexo de detergente proteico é agora facilmente separado da membrana. O detergente torna o complexo solúvel em soluções aquosas, e pronto para a reconstituição em uma membrana artificial.
Proteínas são frequentemente reconstituídas nas membranas dos lipossomos, que são vesículas artificiais. Para preparar lipossomos, os lipídios secos são hidratados e agitados para induzir a formação de vesículas. Quando um detergente é adicionado, ele é incorporado nas membranas liposso.
Para reconstituir a proteína, as proteínas solubilizadas e lipossomos são combinados, e então o detergente é removido da solução por diálise ou adsorção química. As proteínas e lipossomos rapidamente se reúnem em proteoliposomes, de modo que apenas os grupos hidrofílicos são expostos. As proteínas então funcionam como em uma membrana celular, e podem ser investigadas isoladamente.
Agora que cobrimos o básico da reconstituição de proteínas, vamos passar por cima de um protocolo para reconstituir proteínas de membrana em lipossomos.
Para começar a isolar as proteínas da membrana, as células são lísedas. Células ininterruptas são removidas com centrifugação.
O supernante é centrifugado a uma velocidade mais alta para pelotar as membranas. A pelota é re-suspensa e um detergente é adicionado para extrair as proteínas.
Os detritos restantes das células são removidos por centrifugação adicional. A proteína é purificada do supernaspeico com cromatografia de coluna e, em seguida, concentrada ou purificada ainda mais conforme necessário.
Para começar a preparar os lipossomos, uma suspensão de fosfolipídios em solvente orgânico é seca sob nitrogênio ou argônio.
Os fosfolipídios são hidratados com tampão de hidratação, e a mistura é sônica para terminar de criar os lipossomos.
O detergente é adicionado para solubilizar os lipossomos, que é então combinado com as proteínas.
O detergente é então removido por adsorção em contas de poliestireno, diálise ou uma coluna de ligação de detergente. Os proteolipósmos resultantes estão prontos para serem purificados e usados em experimentos subsequentes.
Agora que você está familiarizado com o básico de um procedimento de reconstituição de proteínas de membrana, vamos olhar para algumas aplicações de reconstituição de proteínas na bioquímica.
Uma proteína de transporte de membrana foi reconstituída para obter uma compreensão mais clara de seu mecanismo de transporte. Sua função pós-reconstituição foi verificada com um efflux de íons iodetos. Em seguida, a atividade de transporte foi estudada na presença de vários inibidores e potencializadores de canais de íons de moléculas pequenas. Dessa forma, as interações diretas dessas pequenas moléculas com a proteína de transporte poderiam ser estudadas.
Proteínas de membrana de ligação de clorofila e carotenoides nas plantas colhem luz, promovem a separação da carga e mitigam danos leves. Ao reconstituir essas proteínas de colheita de luz, sua dinâmica dobrável e interação com pigmentos podem ser estudadas. As proteínas de colheita leve reconstituídas com esta técnica tinham propriedades ópticas muito semelhantes às proteínas nativas. A espectroscopia de emissão de fluorescência pode então ser usada para estudar a transferência de energia de pigmentos para as proteínas reconstituídas de colheita de luz.
Você acabou de ver o vídeo do JoVE sobre a reconstituição de proteínas de membrana. A reconstituição é uma maneira de transferir proteínas importantes para uma imitação celular para uma investigação mais aprofundada. Este vídeo abordou os princípios da reconstituição de proteínas, um protocolo de reconstituição e algumas aplicações em bioquímica. Obrigado por assistir!
Procedura
Divulgazioni
Trascrizione
Reconstitution is the process of restoring an isolated biomolecule to its original form or functionality. This approach is often used when studying membrane proteins, which enable many important cellular processes and affect the behavior of neighboring lipids. However, the complexity of the cell environment makes membrane protein functions difficult to study in situ. The proteins can be extracted and purified, but their actual functions cannot be evaluated without a membrane. Therefore, isolated membrane proteins are reconstituted by integration into an artificial lipid membrane, such as a liposome. This video will introduce the principles of membrane protein reconstitution, a general reconstitution procedure, and a few applications in biochemistry.
Cell membranes primarily consist of phospholipids and membrane proteins. The phospholipids form a bilayer in which the hydrophilic phosphate heads interact with the aqueous interior and exterior of the cell, while the hydrophobic fatty acid tails interact with each other in the bilayer.
Some membrane proteins only interact with the membrane by electrostatic or noncovalent interactions. Others, called ‘integral proteins’, are embedded in the lipid bilayer.
Like the bilayer, integral proteins have hydrophilic ends and a hydrophobic center, and are held in place by hydrophobic interactions. Integral proteins that span the entire membrane are known as ‘transmembrane proteins’.
The interactions between these proteins and the membrane are so strong that even lysing the cells will not separate them. A special surfactant called a detergent is used to extract the proteins. Similar to phospholipids, detergents have hydrophilic heads and lipophilic tails, and can enter the membrane freely.
Inside the membrane, the lipophilic tails of the detergent interact with the hydrophobic protein core. This surrounds the protein with a shell of the hydrophilic detergent heads, which disrupts the protein-lipid interactions.
The protein-detergent complex is now easily separated from the membrane. The detergent makes the complex soluble in aqueous solutions, and ready for reconstitution in an artificial membrane.
Proteins are often reconstituted in the membranes of liposomes, which are artificial vesicles. To prepare liposomes, dried lipids are hydrated and agitated to induce vesicle formation. When a detergent is added, it is incorporated into the liposome membranes.
To reconstitute the protein, the solubilized proteins and liposomes are combined, and then the detergent is removed from solution by dialysis or chemical adsorption. The proteins and liposomes rapidly assemble into proteoliposomes, so only the hydrophilic groups are exposed. The proteins then function as they would in a cell membrane, and can be investigated in isolation.
Now that we’ve covered the basics of protein reconstitution, let’s go over a protocol for reconstituting membrane proteins in liposomes.
To begin isolating the membrane proteins, the cells are lysed. Unbroken cells are removed with centrifugation.
The supernatant is centrifuged at a higher speed to pellet the membranes. The pellet is re-suspended and a detergent is added to extract the proteins.
The remaining cell debris is removed by additional centrifugation. The protein is purified from the supernatant with column chromatography and then concentrated or purified further as needed.
To begin preparing the liposomes, a suspension of phospholipids in organic solvent is dried under nitrogen or argon.
The phospholipids are hydrated with hydration buffer, and the mixture is sonicated to finish creating the liposomes.
Detergent is added to solubilize the liposomes, which is then combined with the proteins.
The detergent is then removed by adsorption onto polystyrene beads, dialysis, or a detergent-binding column. The resulting proteoliposomes are ready to be purified and used in subsequent experiments.
Now that you are familiar with the basics of a membrane protein reconstitution procedure, let’s look at a few applications of protein reconstitution in biochemistry.
A membrane-transport protein was reconstituted to gain a clearer understanding of its transport mechanism. Its function post-reconstitution was verified with an efflux of iodide ions. Then, the transport activity was studied in the presence of various small molecule ion channel inhibitors and potentiators. In this way, the direct interactions of these small molecules with the transport protein could be studied.
Chlorophyll and carotenoid-binding membrane proteins in plants harvest light, promote charge separation, and mitigate light damage. By reconstituting these light-harvesting proteins, their folding dynamics and interaction with pigments can be studied. The light-harvesting proteins reconstituted with this technique had very similar optical properties to the native proteins. Fluorescence emission spectroscopy can then be used to study energy transfer from pigments to the reconstituted light-harvesting proteins.
You’ve just watched JoVE’s video on reconstitution of membrane proteins. Reconstitution is a way to transfer important proteins to a cell mimic for further investigation. This video covered the principles of protein reconstitution, a reconstitution protocol, and a few applications in biochemistry. Thanks for watching!
