التدفق الخلوي لتقدير لوكيميا الخلايا الجذعية في الابتدائي سرطان الدم النقوي الحاد والمريض-المشتقة-تكثيفها، في التشخيص والمتابعة حتى
Summary
أننا مخطط بروتوكول للكشف عن التعبير المتزامن للوكيميا الخلايا الجذعية علامات على الخلايا الأولية من سرطان الدم النقوي الحاد بالتدفق الخلوي. نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها.
Abstract
سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو غير المتجانسة، وإذا لم تعالج، المرض المميت. هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم لدى البالغين. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض خلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة من اللوكيميا انفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. عدم التجانس ويمتد إلى وجود الخلايا الجذعية اللوكيميا (المهارات)، مع هذه الخلية الحيوية المقصورة المتطورة للتغلب على الضغوط المختلفة اختيار المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. لتعريف السكان احلركه، يسمح إضافة CD90 و CD45RA بالتمييز هسكس الطبيعي وفروعه multipotent داخل المقصورة الخلايا CD34 + CD38. هنا، فإننا مخطط بروتوكولا للكشف عن التعبير المتزامن لعدة علامات احلركه المفترضة (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الخلايا الانفجار الأساسي للبشرية في مكافحة غسل الأموال بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي. وعلاوة على ذلك، نعرض كيفية قياس الثلاث السلف السكان وعدد سكانها احلركه المفترضة مع زيادة درجة من النضج. نحن أكدت وجود هؤلاء السكان في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها. يمكن استخدام هذا الأسلوب للكشف والتحديد الكمي للمهارات المفترضة للمتابعة السريرية لاستجابة العلاج الكيميائي (أي.، الحد الأدنى من الأمراض المتبقية)، كما احلركه المتبقية قد تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال.
Introduction
سرطان الدم النقوي الحاد (مكافحة غسل الأموال) هو السبب الأكثر شيوعاً للوفيات المرتبطة بسرطان الدم. في البداية، مكافحة غسل الأموال هو مرض الاستنساخ من الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSC) تتميز بإلقاء القبض على التمايز، تراكم اللاحقة لانفجار الخلايا، وانخفاض إنتاج عناصر المكونة للدم الوظيفية. في الآونة الأخيرة، أنشئت الاستنساخ تنافر انفجار الخلية أساسا باستخدام استراتيجيات التسلسل (خ ع) الجيل المقبل، وتشير إلى وجود تطور الاستنساخ داخل ورم الخلايا1.
عدم تجانس يمتد إلى وجود الخلايا الجذعية ليوكيميك (المهارات). هو الافتراض بأن تتطور هذه المقصورة الخلية الحيوية للتغلب على الضغوط التحديد المختلفة المفروضة أثناء تطور سرطان الدم والعلاج. ولذلك يفترض أن تكون مقاومة لنظم العلاج الكيميائي الحالي والتوسط في انتكاس المرض، مع آثار عميقة السريرية2احلركه. وقد وصف علامات مختلفة لتوصيف احلركه مثل CD1233, CLL-14، CD975 أو تيم-36. يعتبر الإثراء احلركه7 CD34 + CD38-حجرة الانفجار الخلايا بل يشمل أيضا HSC العادي. CD90 و CD45RA التعبير ينطبق على CD34 + CD38-المقصورة (P6) (الشكل 1) تصاريح لفصل عدة مراحل من السلائف المكونة للدم العادي والخبيث8. على وجه التحديد، العادي CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-هسكس, multipotent موروث (MPP) مثل CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-الخلايا CD34 + CD38-CD90-CD45RA + يمكن تحديد الخلايا اللمفاوية أعدادا السلف multipotent (لمب) في معظم مكافحة غسل الأموال الحالات8 ،9. الأسفار متوسط الكثافة (MFI) CD38 مهم بشكل خاص النظر داخل المقصورة الخلايا CD34 +. نظراً لكثافة CD38 يحدد ثلاث مقصورات خلية جديدة منها: CD38 السلبية (P6)، CD38 خافت (P7) ومشرق CD38 (P8) (الشكل 1). وقد يحدد مؤسسة مونتانيار CD38 استخدام أما هيماتوجونيس و/أو خلايا البلازما كرقابة داخلية إيجابية كما أعرب هذه الخلايا بشدة CD38.
الطراز الماوسفارغة (مجموعة موردي المواد النووية) العوز إيماءة/نظام/IL2Rγc يستخدم على نطاق واسع ل engraftment عادي والخلايا المكونة للدم الخبيثة الإنسان10،11. وتستخدم فحوصات السلالة المسلسل تجريبيا التحقق من الدالة احلركه أو HSC. هذه الدراسات قد تم تحليلها على نطاق واسع بالنهج تسلسل واسعة النطاق. على الرغم من ذلك، يعرف حول إيمونوفينوتيبي احلركه و HSC لمكافحة غسل الأموال الانفجار السكاني انجرافتيد في الفئران مجموعة موردي المواد النووية مقارنة مكافحة غسل الأموال الأولية (الشكل 2).
إعداد احلركه أصلاً منخفضة وبالتالي، والتحديد الكمي للمهارات التحدي والطريقة الموضحة هنا يمكن استخدامها مقايسة سيتوميتريك تدفق في التشخيص والمتابعة السريرية لتقييم استجابة العلاج الكيميائي (كما قد احلركه المتبقية تسبب الانتكاس مكافحة غسل الأموال). قد يشير إلى وجود احلركه الأمراض المتبقية ضئيلة الإيجابية (MRD). وحتى الآن، رصد في مكافحة غسل الأموال في معظمها تعتمد على الأساليب الجزيئية (أي، الرايت-بكر، خ ع)10،12. بيد في هذا البروتوكول يمكننا الكشف عن التعبير البروتين المتزامن لعدة علامات HSC/احلركه (CD34، CD38، CD45RA، CD90) في الابتدائي انفجار الخلايا لمكافحة غسل الأموال البشرية بتدفق مولتيباراميتريك الخلوي2،،من89. يمكن تطبيق هذا المزيج من الأجسام المضادة في أي مختبر قياس التدفق القياسي وهذا الإنزيم MRD تدفق مثير للاهتمام خاصة عند MRD بالوقت الحقيقي البلمرة المتسلسل (RT-PCR) ليس من الممكن، أيإذا اللوكيميا محددة جزيئية علامات لا يمكن كشفها في العينة التشخيصية مكافحة غسل الأموال. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول، مكمل للتقنيات الجزيئية MRD أكثر حساسية، كما أنها تهدف إلى كشف وتحديد الخلايا غير طبيعية السلف المكونة للدم الذي يمثل إحدى خصائص وظيفية خلية (الشكل 3).
نعرض كيفية قياس الثلاث المكونة للدم السلف السكان وحجرة احلركه المفترضة مع اختلاف درجة النضج بالتدفق الخلوي مع الأجسام المضادة متوفرة في معظم المختبرات السريرية. وعلاوة على ذلك، أكدت وجود هذه المقصورات الخلية في المقابل المريض-المشتقة-تكثيفها (PDX)، وفي العلاج متابعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويتطلب إجراء تقييم دقيق واستنساخه من علامات هيولى بالتدفق الخلوي أو غشاء أن إعدادات أداة يتم التحقق من كل يوم لمحاذاة البصري، سليمة الأداء نظام فلويديك والحساسية الضوئية، وتوحيد استخدام الخرز المعايرة.
الكشف عن خلية انفجار السكان في مكافحة غسل الأموال باستخدام CD90 و CD45RA بت…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
بتأييد هذا العمل جزئيا فيوجين لوريت الرابطة الفرنسية والسرطان le ليجويكونتري (مركز الشمال)، ومؤسسة دي فرنسا (اللوكيميا) “اللجنة”، أونكوليلي SIRIC، ومعهد السرطان الوطني الفرنسي.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Riferimenti
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
