Akış Sitometresi lösemi kök hücre birincil Akut Miyeloid Lösemi ve hasta-türetilen-xenografts, tanı ve takip yukarı tahmin etmek için
Summary
Biz aynı anda ifade birincil akut myeloid lösemi hücreleri üzerinde lösemi kök hücre işaretlerinin Akış Sitometresi tarafından tespit etmek için bir protokol anahat. Biz üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı.
Abstract
Akut Miyeloid Lösemi (AML) heterojen, olduğunu ve eğer tedavi değil, ölümcül hastalık. Erişkinlerde lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, lösemi blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) bir hastalık var. Heterojenite lösemi kök hücreleri (LSC) varlığı uzanır, bu dinamik hücre ile çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bölme gelişen üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında empoze. Daha fazla LSC nüfusu tanımlamak için CD34 + CD38 hücreli bölmenin içinde normal HSCs ve multipotent ataları ayrımcılık CD90 ve CD45RA eklenmesini sağlar. Burada, biz birkaç sözde LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) aynı anda ifade algılamak için bir protokol multiparametric Akış Sitometresi tarafından birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML anahat. Ayrıca, üç yaratıcı nüfus ve artan olgunlaşma derecesi ile sözde bir LSC nüfus ölçmek için nasıl gösterir. Biz bu nüfus içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts varlığını doğruladı. Bu yöntem algılama ve sözde LSC miktar kemoterapi yanıt klinik izlemek için kullanılan (i.e., minimal rezidüel hastalık), kalan LSC AML nüks neden olabilir gibi.
Introduction
Akut Miyeloid Lösemi (AML) Lösemi ilişkili ölümlerin en sık nedenidir. Başlangıçta, AML farklılaşma, blast hücrelerinin sonraki birikimi tutuklanması tarafından karakterize ve üretim fonksiyonel hematopoetik öğelerinin azaltılmış hematopoetik kök hücre (HSC) klonal bir hastalık var. Son zamanlarda, klonal heterojenite blast hücre nüfusunun aslında gelecek nesil sıralama (NGS) stratejileri kullanarak ve tümör hücreleri1intra klonal evrimi varlığını gösteren kurulmuştur.
Heterojenite lösemik kök hücreleri (LSC) varlığı için genişletir. Bunun üzerine lösemi ilerleme ve tedavi sırasında uygulanan çeşitli seçim baskıların üstesinden gelmek için bu dinamik hücre bölümü geliştikçe onaylanmadığına karar. Bu nedenle LSC gereken geçerli kemoterapi rejimleri için dayanıklı ve derin klinik sonuçları2ile hastalık nüks aracılık. Çeşitli işaretler LSC CD1233, CLL-14, CD975 veya TIM-36gibi karakterize etmek için tarif edilmistir. CD34 + CD38 bölmeli blast hücrelerinin LSC’yi7 için zenginleştirilmiş kabul edilir ancak normal HSC içerir. CD34 + CD38 uygulanan CD90 ve CD45RA ifade-(P6) yuvası (şekil 1) izin veren çeşitli aşamalarında normal ve malign hematopoetik öncüleri8ayırmak için. Özellikle, normal CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-HSCs, multipotent ataları (MPP) CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-hücreleri ve CD34 + CD38 gibi-CD90-CD45RA + multipotent progenitör (LMPP) astarlanmalıdır lenfoid hücrelerin AML çoğunluğu olarak belirlenen durumlarda8 ,9. (MFI) ortalama Floresans yoğunluğunu CD38 CD34 + hücre bölmesi içinde dikkate alınması gereken özellikle önemlidir. CD38 yoğunluk üç yeni cep bölmeleri bunların tanımladığından: CD38 negatif (P6) CD38 dim (P7) ve CD38 parlak (P8) (şekil 1). CD38 MFI bu hücreler şiddetle CD38 hızlı gibi ya hematogones ve/veya plazma hücreleri bir iç pozitif kontrol kullanarak belirlenebilir.
İmmünyetmezligi başını SALLAMAK/SCID/IL2Rγcnull (NSG) fare modeli normal engraftment için yaygın olarak kullanılır ve10,11kötü huylu insan hematopoetik hücreler. Seri xenotransplantation deneyleri deneysel LSC veya HSC işlevini doğrulamak için kullanılır. Bu çalışmalar geniş büyük ölçekli sıralama yaklaşımlar tarafından analiz edilmiştir. Yine de, daha az onun birincil AML (Şekil 2) karşılaştırıldığında NSG fareler içine engrafted AML patlama nüfus LSC ve HSC immunophenotype hakkında bilinir.
LSC sayıda böylece doğal olarak düşük, kimlik ve LSC miktar zor olan ve burada anlatılan yöntemi bir akış sitometrik tahlil tanı ve klinik takip (kalıntı LSC olabilir gibi kemoterapi yanıtı değerlendirmek için kullanılıyor olabileceği AML relapse) neden. LSC varlığı olumlu minimal rezidüel hastalık (MRD) gösterebilir. Bugüne kadar MRD AML içinde çoğunlukla izleme itimat moleküler yöntemler (Yani, RT-PCR, NGS)10,12. Ancak, bu protokol için biz aynı anda protein ifade çeşitli HSC/LSC işaretleri (CD34 CD38 CD45RA, CD90) birincil blast hücrelerinin üzerinde insan AML multiparametric Akış Sitometresi2,8,9tarafından tespit. Antikorlar bu arada herhangi bir standart Akış Sitometresi laboratuvarda uygulanabilir ve bu akışı MRD tahlil özellikle ilginç olduğunda MRD tarafından gerçek zamanlı Polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) mümkün değildir Yani, eğer lösemi özel moleküler işaretleyicileri tanılama AML örnekte algılanabilir değildir. Ayrıca, bu iletişim kuralını, daha hassas moleküler MRD teknikleri için tamamlayıcı bu tespit ve anormal hematopoetik progenitör hücre ölçmek için amaç gibi temsil eden bir işlev hücre karakteristik (şekil 3).
Akış Sitometresi ile antikor klinik laboratuvarlar çoğunda kullanılabilir tarafından üç hematopoetik progenitör nüfus ve sözde LSC yuvası ile farklı olgunlaşma derecesini ölçmek için nasıl gösterir. Ayrıca, bu hücre bölmeleri içinde karşılık gelen hasta-türetilen-xenografts (PDX) varlığını doğruladı ve tedavi takip.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enstrüman ayarlarını her gün optik uyum, sıvı sistemi, optik duyarlılık ve standardizasyon işlevlerin doğru için doğrulanır membran veya Akış Sitometresi tarafından sitoplazmik işaretleri doğru ve tekrarlanabilir değerlendirilmesi gerektirir kalibrasyon boncuk kullanarak.
CD90 ve CD45RA göre çok parametrik Akış Sitometresi Analizi kullanarak AML blast hücre popülasyonlarının tespiti nispeten basit ve güvenilir bir yöntemdir. Bu analizi kritik bir adımda doğru CD3…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser kısmen Fransızca Derneği Laurette Fugain, LigueContre le kanser (Kuzey Merkezi), Fondation de France (lösemi Komitesi), SIRIC Oncolille ve Fransız Ulusal Kanser Enstitüsü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Riferimenti
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
