Проточная цитометрия оценить стволовых клеток лейкемии в первичных острый миелолейкоз и пациент производные ксенотрасплантатов, диагностики и последующей вверх
Summary
Мы наметим протокол для обнаружения одновременной выражение маркеров стволовых клеток лейкемии на первичной острой миелоидной лейкемии клеток проточной цитометрии. Мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов.
Abstract
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является неоднородной и если не лечить, смертельной болезни. Это является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности взрослых. Первоначально бод-болезнь гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление лейкозных клеток взрыва и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Гетерогенность распространяется на наличие стволовых клеток лейкемии (LSC), с этой ячейкой динамический отсека развивается преодолевать различные отбора давления навязана при лейкемии прогрессии и лечения. Для дальнейшего определения LSC населения, помимо CD90 и CD45RA позволяет дискриминации нормальной СКК и Multipotent с прародителями в отсеке CD34 + CD38-клеток. Здесь мы приводим протокол обнаружения одновременной выражение несколько предполагаемых LSC маркеров (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ, многопараметрических проточной цитометрии. Кроме того мы покажем, как определить количественно 3 прародителем населения и предполагаемым LSC населения с увеличением степени созревания. Мы подтвердили наличие этих групп населения в соответствующих пациента производные ксенотрасплантатов. Этот метод обнаружения и количественного определения предполагаемого LSC может использоваться для клинических решений ответ химиотерапии (т.е., минимальной остаточной болезни), как остаточная LSC может привести к бод рецидива.
Introduction
Острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) является наиболее распространенной причиной лейкемии связанные смертности. Первоначально бод является клоновых болезни гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) характеризуется арест дифференциации, последующее накопление взрыва клеток и сократил производство функциональных кроветворных элементов. Недавно клоновые гетерогенность популяции клеток взрыв был создан по существу с помощью следующего поколения стратегии виртуализации (НГС) и показаны существование внутри клональная эволюция опухолевые клетки1.
Гетерогенность распространяется на наличие лейкозных стволовых клеток (LSC). Можно предположить, что этот отсек динамических клеток развивается преодолевать различные отбора давления, навязанной при лейкемии прогрессии и лечения. Поэтому LSC должны быть устойчивы к ТЭК химиотерапевтического и посредником рецидива заболевания, с глубоким клинические последствия2. Были описаны различные маркеры для характеристики LSC как CD1233,4ХЛЛ-1, CD975 или Тим-36. CD34 + CD38-купе взрыва клеток считается обогащаться LSC7 , но также включает в себя обычный HSC. CD90 и CD45RA выражение применяется к CD34 + CD38-(P6) отсека (рис. 1) позволяет отделить несколько этапов нормальных и злокачественных кроветворных прекурсоров8. В частности, нормальный CD34 + CD38-CD90 + CD45RA-СКК, Multipotent с прародителями (MPP) как CD34 + CD38-CD90dimCD45RA-клеток и CD34 + CD38-CD90-CD45RA + клетки-предшественники Multipotent с лимфоидных загрунтовать (LMPP) может быть определена в большинстве ОМЛ случаях8 ,9. Интенсивность средняя флуоресцирования (MFI) CD38 особенно важно рассматривать в отсеке CD34 + клеток. Потому что CD38 интенсивности определяет три новых клеточных компартментов их: CD38 отрицательной (P6), CD38 Дим (P7) и CD38 яркий (P8) (рис. 1). МФО CD38 может определяться с помощью hematogones и/или плазматические клетки как позитивный внутренний контроль как эти клетки решительно выразить CD38.
Иммунодефицитных NOD/SCID/IL2Rγcзначение null (ГЯП) мыши модель широко используется для приживления нормальных и злокачественных человека гемопоэтических клеток10,11. Серийный ксенотрансплантации анализы используются для экспериментально проверить функцию LSC или HSC. Эти исследования были подробно проанализированы больших масштабах последовательности подходов. Тем не менее меньше известно о СОП и HSC иммунофенотип ПФТ взрыва населения прижившимися в ГЯП мышей, по сравнению с его основной AML (рис. 2).
Количество LSC низких таким образом, идентификация и количественная оценка LSC сложной и метод, описанный здесь могут использоваться как assay гранулярных потока на диагностике и клинической следовать для оценки реакции химиотерапии (как остаточная LSC может вызвать рецидив бод). Присутствие LSC может указывать положительное минимальной остаточной болезни (моб). На сегодняшний день, моб мониторинг в AML главным образом полагаться на молекулярные методы (т.е., RT-PCR, NGS)10,12. Однако в этом протоколе мы обнаружить одновременных белков несколько маркеров HSC/LSC (CD34 CD38, CD45RA, CD90) на первичный взрыв клетки человека ОМЛ многопараметрических потока цитометрии2,8,9. Эта комбинация антител может применяться в любой лаборатории цитометрии стандартного потока и этот assay MRD потока особенно интересно, когда моб в реальном времени полимеразной цепной реакции (ПЦР) не представляется возможным, то есть, если лейкемии конкретные молекулярные маркеры не обнаруживаются в образце диагностических бод. Кроме того этот протокол, в дополнение к более чувствительным молекулярных методов моб, как он стремится выявлять и количественно клеток-аномальные гемопоэтических предшественников представляет характеристика функционального клеток (рис. 3).
Мы покажем, как определить три популяции гемопоэтических предшественников и предполагаемым LSC отсек с разной степенью созревания подачей cytometry с антителами, доступных в большинстве клинических лабораторий. Кроме того мы подтвердили наличие этих клеточных компартментов в соответствующий пациент производные ксенотрасплантатов (PDX) и на лечение.
Protocol
Representative Results
Discussion
Точные и воспроизводимые оценку мембраны или цитоплазматических маркеров подачей cytometry требует, что инструмент настройки проверяются каждый день для оптических выравнивания, надлежащее функционирование аэрогидродинамических система, оптическая чувствительность и стандартизации с…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддержали французской ассоциации Лоретт Фюгеном, LigueContre le рака (Северный центр), Фонд-де-Франс (лейкоз Комитет), SIRIC Oncolille и французского национального института рака.
Materials
| Pancoll | PAN-Biotech | P04-60500 | |
| RBC Lysis Buffer (10x) | Ozyme | BLE420301 | RBC Lysis solution A : 8.29 g of NH4Cl + 0.037 g of Na2EDTA in 100 mL of sterile H2O and RBC Lysis solution B: 1 g of KHCO3 in 100 mL of sterile H2O |
| NOD/SCID/IL2Rγcnull (NSG) mice | JACKSON LABORATORY | Stock No: 005557 | |
| PBS | Gibco by life technologies | 14190-144 | |
| AutoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer | MACS Buffer Miltenybiotec | 130-091-221 | |
| Anti-CD36-FITC (clone FA6-152, Iotest) | Beckman Coulter | PN IM0766U | |
| Anti-CD33-PC5.5 (clone D3HL60.251, Iotest) | Beckman Coulter | B36289 | |
| Anti-CD90-APC (clone 5E10) | Biolegend | 328114 | |
| Anti-CD19-ECD (clone J3-119, Iotest) | Beckman Coulter | A07770 | |
| Anti-CD34-AA700 (clone 581, Iotest) | Beckman Coulter | B92417 | |
| Anti-CD45RA-APC-H7 (clone HI100) | Beckton Dickinson | 560674 | |
| Anti-CD38-Pacific Blue (clone LSI98-4-3, Iotest) | Beckman Coulter | B92396 | |
| Anti-CD45-KO (clone J.33, Iotest) | Beckman Coulter | B36294 | |
| Anti-CD3-PE | Beckman Coulter | IM1451 | |
| Anti-CD20-PE | Beckman Coulter | A07747 | |
| Anti-CD123-PC7 | Beckman Coulter | B13647 | |
| Flow-Set | Beckman Coulter | A63492 | |
| Flow-Check | Beckman Coulter | A63493 | |
| Navios | Beckman Coulter | DS-14644A | |
| LSR Fortessa X20 | BD Biosciences | ||
| CST BD | BD Biosciences | 655051 | |
| FacsFlow | BD Biosciences | 336911 | |
| Anti-hCD45-FITC | Biolegend | BLE304006 | |
| Anti-mCD45-APC | Biolegend | BLE103112 | |
| EasySep human PE selection kit | Stem Cell Technologies | 18000 | |
| EasySep magnet | Stem Cell Technologies | 18551 |
Riferimenti
- Shlush, L. I., et al. Tracing the origins of relapse in acute myeloid leukaemia to stem cells. Nature. , (2017).
- Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9 (9), e107587 (2014).
- Jordan, C. T., et al. The interleukin-3 receptor alpha chain is a unique marker for human acute myelogenous leukemia stem cells. Leukemia. 14 (10), 1777-1784 (2000).
- van Rhenen, A., et al. The novel AML stem cell associated antigen CLL-1 aids in discrimination between normal and leukemic stem cells. Blood. 110 (7), 2659-2666 (2007).
- Bonardi, F., et al. A proteomics and transcriptomics approach to identify leukemic stem cell (LSC) markers. Mol Cell Proteomics. 12 (3), 626-637 (2013).
- Kikushige, Y., Miyamoto, T. Identification of TIM-3 as a Leukemic Stem Cell Surface Molecule in Primary Acute Myeloid Leukemia. Oncology. 89, 28-32 (2015).
- Bonnet, D., Dick, J. E. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med. 3 (7), 730-737 (1997).
- Kersten, B., et al. CD45RA, a specific marker for leukaemia stem cell sub-populations in acute myeloid leukaemia. Brit J Haematol. 173 (2), 219-235 (2016).
- Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
- Ng, S. W., et al. A 17-gene stemness score for rapid determination of risk in acute leukaemia. Nature. 540 (7633), 433-437 (2016).
- Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J. Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
- Roloff, G. W., Lai, C., Hourigan, C. S., Dillon, L. W. Technical Advances in the Measurement of Residual Disease in Acute Myeloid Leukemia. J Clin Med. 6 (9), (2017).
- Swamydas, S., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. (77), e50586 (2013).
- Gabert, J., et al. Standardization and quality control studies of ‘real-time’ quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia – a Europe Against Cancer program. Leukemia. 17 (12), 2318-2357 (2003).
