Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing
Summary
Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer “Domainome”-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.
Abstract
Klappbare Reporter sind Proteine mit leicht erkennbaren Phänotypen, wie z. B. Antibiotika-Resistenz, dessen Falten und Funktion beeinträchtigt wird, wenn schlecht Faltung von Proteinen oder zufällige open Reading Frames verschmolzen. Wir haben eine Strategie entwickelt, kann mithilfe von TEM-1 β-Lactamase (das Enzym überträgt die Ampicillin-Resistenz) auf genomischer Ebene, Sammlungen von korrekt gefaltete Protein Domains wählen wir aus der Codierung Teil der DNA von jedem intronless Genom. Die PROTEINFRAGMENTE erhalten durch diesen Ansatz, der so genannte “Domainome”, werden gut ausgedrückt und löslich, so dass sie für strukturelle und funktionelle Studien sein.
Von Klonen und die Anzeige “Domainome” direkt in einem Phagen-Display-System, haben wir zeigten, dass spezifisches Protein Domains mit der gewünschten Bindeeigenschaften (z. B. an andere Proteine oder Antikörper), wählen dadurch wesentlich kann experimentellen Daten für gen-Annotation oder Antigen-Identifikation.
Die Identifikation der meisten angereicherten Klone in einer ausgewählten polyklonale Population kann mithilfe von Technologien neuartige Next Generation Sequencing (NGS) erreicht werden. Aus diesen Gründen stellen wir Tiefe Sequenzierung Analyse der Bibliothek selbst und die Auswahl-Ausgänge, komplette Informationen über Vielfalt, Fülle und genaue Kartierung aller ausgewählten Fragment. Die hier vorgestellten Protokolle zeigen die wichtigsten Schritte für Bibliotheksbau, Charakterisierung und Validierung.
Introduction
Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode für den Bau und die Auswahl der Bibliotheken der gefalteten und lösliches Protein Domänen aus jeder genic/genomische ab Quelle. Der Ansatz kombiniert drei verschiedene Technologien: Phagen-Display, die Verwendung eines klappbaren Reporter und nächsten Generation Sequencing (NGS) mit einer speziellen Web-Tool für die Datenanalyse. Die Methoden können in vielen verschiedenen Zusammenhängen von Protein-basierten Forschung verwendet werden, für Identifikation und Kommentierung der neuen Proteine-Eiweiß-Domains, Charakterisierung von strukturellen und funktionellen Eigenschaften des bekannten Proteine sowie Definition von Protein-Interaktion Netzwerk.
Viele offene Fragen sind nach wie vor in Protein-basierten Forschung und die Entwicklung von Methoden für optimale Protein-Produktion ist eine wichtige Notwendigkeit für mehrere Felder der Untersuchung. Zum Beispiel fehlt trotz der Verfügbarkeit von Tausenden von prokaryotischen und eukaryotischen Genomen1, eine entsprechende Karte von der relativen Proteome mit eine direkte Anmerkung der kodierten Proteine und Peptide für die große Mehrheit der Organismen. Der Katalog der komplette Proteome taucht als ein anspruchsvolles Ziel, einen riesigen Aufwand an Zeit und Ressourcen erfordern. Der Goldstandard für experimentelle Annotation bleibt das Klonen von alle Open Reading Frames (ORFs) eines Genoms Bau der so genannten “ORFeome”. In der Regel Genfunktion Basierend auf Homologie zu verwandten Genen bekannte Tätigkeit zugewiesen, aber dieser Ansatz ist schlecht genau aufgrund der Anwesenheit von vielen falschen Anmerkungen in der Referenz Datenbanken2,3,4, 5. Darüber hinaus auch für Proteine, die identifiziert und kommentiert haben, zusätzliche Studien sind verpflichtet, Charakterisierung in Bezug auf Fülle, Expressionsmuster in unterschiedlichen Kontexten, einschließlich der strukturelle und funktionelle Eigenschaften sowie Interaktion-Netzwerke.
Darüber hinaus da Proteine aus verschiedenen Domänen, jeder von ihnen bestehen zeigt Besonderheiten und anders zu Proteinfunktionen beitragen, die Studie und die genaue Definition dieser Domains können ein noch umfassenderes Bild, sowohl bei den einzelnen gen und auf das vollständige Genom-Ebene. Diese notwendigen Informationen macht Protein-basierten Forschung einem breiten und anspruchsvollen Bereich.
In dieser Perspektive könnte ein wichtiger Beitrag durch unvoreingenommene und Hochdurchsatz-Methoden für die Proteinproduktion gegeben werden. Allerdings beruht der Erfolg solcher Ansätze, neben der erheblichen Investition erforderlich ist, auf der Fähigkeit, lösliche/Stall Protein Konstrukte zu produzieren. Dies ist ein wichtiger Faktor zu begrenzen, da es wurde geschätzt, dass nur etwa 30 % der Proteine können erfolgreich ausgedrückt und produziert in ausreichendem Maße experimentell nützlich6,7,8. Eine Annäherung an diese Beschränkung zu überwinden basiert auf der Verwendung von nach dem Zufallsprinzip fragmentierte DNA herstellen verschiedene Polypeptide, die zusammen überlappende Fragment Darstellung einzelner Gene. Nur ein kleiner Prozentsatz der zufällig generierte DNA-Fragmente sind funktionale ORFs, während die große Mehrheit von ihnen sind nicht-funktionale (wegen des Vorhandenseins des Stop-Codons in ihre Sequenzen) oder codieren für unnatürlich (ORF in einem Frame als das Original) Polypeptide mit keine biologische Bedeutung.
Um diese Probleme zu beheben, hat unsere Fraktion eine Hochdurchsatz-Protein Ausdruck und Interaktion Analyse-Plattform entwickelt, die auf genomischer Ebene9,10,11,12verwendet werden kann. Diese Plattform integriert die folgenden Techniken: 1) eine Methode, um Sammlungen von korrekt gefaltete Protein Domains wählen Sie die Codierung Teil der DNA von jedem Organismus; (2) die Phagen-Display-Technologie für die Auswahl der Partner von Interaktionen; (3) die NGS vollständig charakterisieren die ganze Interaktom untersucht und die Klone von Interesse zu identifizieren; und 4) eine Web-Tool für die Datenanalyse für Anwender ohne Programmierkenntnisse oder Bioinformatik Interaktom-Seq-Analyse in eine einfache und benutzerfreundliche Weise durchführen.
Die Nutzung dieser Plattform bietet wichtige Vorteile gegenüber alternativen Strategien der Untersuchung; die Methode ist vor allem völlig unvoreingenommene, Hochdurchsatz- und modular für Studie, die von einem einzigen Gen bis zu einem ganzen Genom. Der erste Schritt der Pipeline ist die Schaffung einer Bibliothek von nach dem Zufallsprinzip fragmentierte DNA unter Studie, die von NGS dann tief geprägt ist. Diese Bibliothek wird über ein veränderter Vektor wo werden Gene/Fragmente des Interesses geklont, zwischen einer Signalsequenz für Protein Sekretion in den periplasmatischen Raum (d.h. ein Sec-Führer) und das TEM1 β-Lactamase-gen erzeugt. Fusionsproteins wird Ampicillin-Resistenz und die Fähigkeit, unter Druck von Ampicillin nur überleben, wenn geklonten Fragmente im Rahmen sind verleihen diese Elemente und die daraus resultierenden Schmelzverfahren Protein ist korrekt gefaltet10,13 ,14. Alle Klone gerettet, nachdem Antibiotika Auswahl, die so genannte “gefiltert-Klone”, sind ORFs und eine große Mehrheit von ihnen (mehr als 80 %), echte Gene9abgeleitet sind. Darüber hinaus liegt die Stärke dieser Strategie in die Ergebnisse, dass alle ORF gefiltert Klone für korrekt gefaltet/lösliche Proteine/Domänen15codieren. Wie viele Klone, vorhanden in der Bibliothek und die Zuordnung in der gleichen Region/Domäne, verschiedene Start- und Endpunkte haben, ermöglicht das unvoreingenommene, einstufigen Identifikation der minimale Fragmente, die lösliche Produkte führen dürften.
Eine weitere Verbesserung in der Technologie ist durch die Verwendung von NGS gegeben, um die Bibliothek zu charakterisieren. Die Kombination dieser Plattform und eine spezielle Web-Tool für die Datenanalyse gibt wichtige objektive Informationen über die genauen Nukleotidsequenzen und über den Standort des ausgewählten ORFs auf dem Referenz-DNA unter Studie ohne weitere umfangreiche Analysen oder experimentellen Aufwand.
Domainome Bibliotheken können in einem Auswahlkontext übertragen und als ein universelles Instrument verwendet, um funktionelle Studien durchführen. Die Hochdurchsatz-Protein Ausdruck und Interaktion Analyseplattform, dass wir integriert und dass wir Interaktom-Seq genannt die Phagen-Display-Technologie nutzt durch Übertragung den gefilterten ORF in einen Phagemid Vektor und die Schaffung von einem Phagen-ORF Bibliothek. Einmal neu geklont in einem Phagen Anzeigekontext Protein Domains auf der Oberfläche der M13 Partikel angezeigt; auf diese Weise können Domainome Bibliotheken für Genfragmente Codierung Domains mit spezifischen enzymatischen Aktivitäten oder bindende Eigenschaften, so dass Interaktom Netzwerke Profilerstellung direkt ausgewählt werden. Dieser Ansatz wurde ursprünglich von Zacchi Et Al. beschrieben. 16 und später in mehreren anderen Kontext13,17,18verwendet.
Im Vergleich zu anderen Technologien zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktion (einschließlich Hefe-zwei-Hybrid-System und Massenspektrometrie19,20), ist ein großer Vorteil die Verstärkung der Bindungspartner, die auftritt, während Phagen mehrfache Umläufe der Auswahl angezeigt. Dies erhöht die Auswahl-Empfindlichkeit, so dass die Identifizierung der niedrigen reichlich Bindeproteine Domänen in der Bibliothek vorhanden. Die Effizienz der Auswahl mit ORF-gefilterte Bibliothek durchgeführt wird aufgrund des Fehlens von nicht-funktionalen Klone weiter erhöht. Schließlich ermöglicht die Technologie die Auswahl gegen Eiweiß und nicht-Protein Köder21,22,23,24,25durchgeführt werden.
Phagen-Auswahl mit Hilfe der Domainome-Phagen-Bibliothek können mit Antikörpern im Serum von Patienten mit verschiedenen pathologischen Bedingungen, z.B. Autoimmunerkrankungen13, Krebs oder Infektionen Krankheiten als Köder aus durchgeführt werden. Dieser Ansatz wird verwendet, um zu erhalten die so genannte “Antikörper Signatur” der Krankheit unter Studie damit massiv zu identifizieren und zu charakterisieren die Antigene/Epitope speziell zur gleichen Zeit von der Patienten Antikörper erkannt. Im Vergleich zu anderen Methoden der Verwendung von Phagen-Display ermöglicht die Identifikation von sowohl lineare als auch Konformationsänderungen Antigenen Epitope. Die Identifikation einer bestimmten Signatur könnte einen wichtigen Einfluss für Verständnis Pathogenese, neue Impfstoff-Design, Identifikation von neuen therapeutischen Ziele und Entwicklung von neuen und spezifischen diagnostischen und prognostischen Tools haben. Darüber hinaus Wenn die Studie auf Infektionskrankheiten konzentriert ist, ist ein großer Vorteil, dass die Entdeckung der Immunogenen Proteine unabhängig vom Erreger Anbau.
Unser Ansatz bestätigt, dass die Faltung Reporter auf genomischer Ebene verwendet werden können, um die “Domainome” wählen: eine Sammlung von korrekt gefaltet, gut ausgedrückt, lösliches Protein Domains aus der Codierung Teil der DNA bzw. cDNA von jedem Organismus. Einmal isoliert die PROTEINFRAGMENTE eignen sich für viele Zwecke, mit wesentlichen experimentelle Informationen für gen-Anmerkungen sowie für strukturelle Studien, Antikörper Epitop Mapping, Antigen-Identifikation. Die Vollständigkeit der Hochdurchsatz-Daten zur Verfügung gestellt von NGS ermöglicht die Analyse von hochkomplexen Proben, wie Phagen-Display-Bibliotheken, und hat das Potenzial, das traditionelle mühsam sammeln und Prüfung von einzelnen Phagen gerettet Klone zu umgehen.
Zur gleichen Zeit dank der Funktionen der gefilterten Bibliothek und die extreme Empfindlichkeit und macht die NGS-Analyse ist es möglich, die Protein-Domäne verantwortlich für jede Interaktion direkt in ein Einstiegsbild, ohne die Notwendigkeit der Schaffung zu identifizieren zusätzliche Bibliotheken für jede gebunden Protein. NGS ermöglicht eine umfassende Definition von der ganzen Domainome gen/genomische ab Quelle und das Web-Tool zur Datenanalyse ermöglicht die Erlangung von eine hochspezifische Charakterisierung von qualitativer und quantitativer Sicht von der Interaktom Proteine Domänen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Schaffung einer qualitativ hochwertige unterschiedlichsten ORFs gefilterte Bibliothek ist der erste wichtige Schritt in dem gesamten Verfahren, da sie die nachfolgenden Schritte der Pipeline beeinflussen.
Ein wichtiges Merkmal der Vorteil unserer Methode ist, dass jede Quelle (intronless) DNA (cDNA, genomische DNA, PCR abgeleitet oder synthetische DNA) geeignet für Bibliotheksbau. Der erste Parameter, der berücksichtigt werden sollte ist, dass die Länge der DNA-Fragmente in der pFILTER-…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem italienischen Ministerium für Bildung und Universität (2010P3S8BR_002, CP).
Materials
| Sonopuls ultrasonic homogenizer | Bandelin | HD2070 | or equivalent |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | or equivalent |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | or equivalent |
| Molecular Biology Agarose | BioRad | 161-3102 | or equivalent |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | or equivalent |
| 6x DNA Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | or equivalent |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | or equivalent |
| Quick Blunting Kit | New England Biolabs | E1201S | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | or equivalent |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | or equivalent |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Sodium Acetate 3M pH5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| DH5aF' bacteria cells | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0,2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1,5 ml tubes | general lab supplier | ||
| 0,1 cm electroporation cuvettes | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| 150 mm plates | general lab supplier | ||
| 100 mm plates | general lab supplier | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
| NheI | New England Biolabs | R0131L | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | or equivalent |
| M13KO7 Helper Phage | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma-Aldrich | P5413 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| PBS | general lab supplier | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10003D | or equivalent |
| MagnaRack Magnetic Separation Rack | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Nonfat dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP beads | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT dual Index Primers | Illumina | FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004 | |
| MiSeq or Hiseq2500 | Illumina | ||
| Spectrophotomer | Nanodrop | ||
| Agilent Bioanalyzer or TapeStation | Agilent | ||
| Forward PCR primer | general lab supplier | 5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
| Reverse PCR primer | general lab supplier | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
| Forward primer for NGS | general lab supplier | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
| Reverse primer for NGS | general lab supplier | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |
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