Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Summary

הפרוטוקולים תיאר מאפשרים אפיון ובניה, מבחר (נגד המטרה של הבחירה) ספרייה “domainome” גרם מכל מקור ה-DNA. זו מושגת על ידי צינור מחקר המשלב טכנולוגיות שונות: phage התצוגה, כתב מתקפלים, רצף הדור הבא עם כלי אינטרנט לניתוח נתונים.

Abstract

כתבים מתקפלים הם חלבונים עם פנוטיפים קלות לזיהוי, כגון עמידות לאנטיביוטיקה, אשר מתקפל ותפקוד נפגעת כאשר דבוקה לקוי קיפול חלבונים או מסגרות קריאה פתוחה אקראי. פיתחנו אסטרטגיה שבו, על-ידי שימוש TEM-1 β לקטמאז (האנזים היוועצות ההתנגדות אמפיצילין) בסולם גנומית, אנחנו יכולים לבחור אוספים של תחומים חלבון מקופל כראוי מן החלק קידוד של ה-DNA של כל הגנום intronless. שברי חלבון מתקבל על ידי גישה זו, שנקרא “domainome”, תהיה ביטוי היטב מסיסים, שהופך אותם למתאימים ללימודי מבני/תפקודית.

שיבוט ומציג את “domainome” ישירות במערכת התצוגה phage, אנחנו הראו שזה אפשרי לבחור תחומים חלבון ספציפי עם מאפייני האיגוד הרצוי (למשל, לחלבונים אחרים או נוגדנים), ובכך לספק חיוני ניסיוני מידע לזיהוי גנים ביאור או אנטיגן.

הזיהוי של שיבוטים מועשר ביותר בקרב אוכלוסיה polyclonal שנבחר יכולה להיות מושגת באמצעות טכנולוגיות הדור הבא רצפי הרומן (הגדרות). מסיבות אלו, אנו מציגים את רצף עמוק ניתוח של הספריה עצמה והתפוקות הבחירה כדי לספק מידע מלא על גיוון, שפע של מיפוי מדויק של כל אחד המקטע שנבחר. הפרוטוקולים המובאת כאן הצגת השלבים המפתח בניית ספרייה, אפיון של אימות.

Introduction

כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה הבנייה ואת הבחירה של ספריות של חלבון מקופל ולא מסיסים תחומים מכל מקור ההתחלה genic/גנומית. הגישה משלבת בשלוש טכנולוגיות שונות: phage לתצוגה, השימוש של כתב מתקפלים, רצף הדור הבא (הגדרות) עם כלי אינטרנט מסוימים עבור ניתוח נתונים. השיטות ניתן להשתמש בהקשרים שונים רבים של חלבון מבוססת מחקר, זיהוי, ביאור של דומיינים חלבונים/חלבונים חדשים, אפיון של מאפיינים מבניים ופונקציונליים של חלבונים הידועים, כמו גם ההגדרה של רשת אינטרקציה בין חלבונים.

שאלות פתוחות רבות עדיין קיימות במחקר המבוסס על חלבון ונמצא בפיתוח שיטות לייצור חלבון אופטימלי של צורך חשוב מספר שדות של החקירה. לדוגמה, למרות זמינותו של אלפי הגנום prokaryotic, האיקריוטים¹, מפת המתאימה proteomes יחסית לביאור ישירה של מקודדת חלבונים ופפטידים חסר עדיין עבור הרוב הגדול של אורגניזמים. הקטלוג של proteomes מוחלט מתגלה כמטרה מאתגר הדורש מאמץ עצום במונחים של זמן ומשאבים. תקן זהב עבור ביאור ניסיוני נשאר השיבוט כל המסגרות פתח קריאה (ORFs) של הגנום, בבניין שנקרא “ORFeome”. בדרך כלל פונקציה ג’ין מוקצה על סמך הומולוגיה ל גנים הקשורים בפעילות ידוע אבל גישה זו היא מדויקת לקוי בשל נוכחותם של רבים ביאורים שגוי הפניה מסדי נתונים^{2,3,4, 5}. יתר על כן, אפילו עבור חלבונים מזוהה, מבואר, מחקרים נוספים נדרשים להשיג אפיון מבחינת שפע, דפוסי ביטוי בהקשרים שונים, כולל מאפיינים מבניים ופונקציונליים כמו גם אינטראקציה עם רשתות.

יתר על כן, מאז חלבונים מורכבים של תחומים שונים, כל אחד מהם מציג תכונות ספציפיות, ותרומה שונה פונקציות חלבון, המחקר ואת ההגדרה המדויקת של תחומים אלה יכול לאפשר תמונה מקיפה יותר, הן ברמה הסינגל ג’ין, ברמת הגנום המלא. כל המידע הנחוץ הזה הופך את חלבון מבוססת מחקר שדה רחב ומאתגר.

בפרספקטיבה הזו, יכול לקבל תרומה חשובה על ידי שיטות לא משוחד ואשר תפוקה גבוהה לייצור חלבונים. עם זאת, ההצלחה של גישות כאלה, לצד ההשקעה ניכרת נדרש, מסתמך על היכולת לייצר חלבון מסיס/יציבה בונה. . זה רב סרן הגבלת גורם שכן ההערכה היא כי רק כ- 30% של חלבונים יכולים להיות בהצלחה הביע והפיק ברמות מספיקות כדי להיות שימושי השפעול^6,7,8. גישה זו על מנת להתגבר על מגבלה זו מבוססת על השימוש של DNA מפוצלים באופן אקראי כדי לייצר polypeptides שונים, אשר יחד מספקים קטעים חופפים, ייצוג גנים יחידניים. רק אחוז קטן של שברי DNA שנוצר באופן אקראי הינם פונקציונליים ORFs בעוד הרוב הגדול של אותם שאינם פונקציונליים (בשל נוכחותם של עצירה codons בתוך והרצפים שלהם) או קידוד עבור האו ם טבעי (ORF בתוך מסגרת שונה מהמקור) polypeptides ללא משמעות ביולוגית.

כדי לטפל בכל הנושאים האלה, הקבוצה שלנו פיתחה תפוקה גבוהה חלבון ביטוי ואינטראקציה ניתוח פלטפורמה שניתן להשתמש בהם על^11,1210,9,מידה גנומית. פלטפורמה זו משלבת הטכניקות הבאות: 1) שיטה לבחירת אוספים של חלבון מקופל כראוי תחומים מתוך החלק קידוד של ה-DNA מכל יצור; 2 טכנולוגית תצוגה phage) בחירת שותפים של אינטראקציות; 3) המיתרים לחלוטין לאפיין את interactome כל שנבחנה ולזהות השיבוטים של עניין; . ו-4) כלי אינטרנט עבור ניתוח נתונים עבור משתמשים ללא ביואינפורמטיקה או בתכנות לבצע ניתוח Interactome-Seq בצורה קלה וידידותית.

השימוש של פלטפורמה זו מציע יתרונות חשובים על אסטרטגיות אלטרנטיביות של החקירה; מעל כל השיטה זו לחלוטין לא משוחד תפוקה גבוהה, מודולרי למחקר החל גן יחיד עד הגנום כולו. השלב הראשון של הצינור הוא היצירה של ספריה מ- DNA באופן אקראי מפוצלים שנבחנה, המתאפיינת ואז עמוקות המיתרים. ספריה זו נוצרת באמצעות וקטור הנדסה שבו גנים/קטעים מעניינים הם משובטים בין רצף אות על הפרשת חלבון לחלל periplasmic (כלומר, מנהיג שניה) הגן β לקטמאז TEM1. החלבון היתוך להתייעץ אמפיצילין ההתנגדות ואת היכולת לשרוד תחת לחץ אמפיצילין רק אם קטעים משוכפל במסגרת עם רכיבים אלה והן את חלבון כימרי וכתוצאה מכך הוא מקופל כראוי^{10,13 ,14}. שיבוטים כל חולצה אחרי הבחירה אנטיביוטי, שנקרא מסוננים המשובטים”, הינם ORFs, רוב גדול של אותם (יותר מ 80 אחוז), נגזרות אמיתי גנים⁹. יתר על כן, הכוח של אסטרטגיה זו טמון הממצאים כי כל השיבוטים ORF מסונן קידוד חלבונים כראוי מקופל/מסיסים/תחומים¹⁵. כמו שיבוטים רבים, נוכח הספריה ואת מיפוי האזור באותו/תחום, יש שונות להתחלה וסיום נקודות, זה מאפשר זיהוי לא משוחדת, צעד אחר צעד של השברים מינימלית כי צפויים להניב מוצרים מסיסים.

הטבה נוספת בטכנולוגיה ניתנת על ידי שימוש המיתרים לאפיין את הספרייה. השילוב של הפלטפורמה ושל כלי אינטרנט מסוימים עבור ניתוח נתונים נותן מידע לא משוחד חשוב על הרצפים נוקלאוטיד המדויק, על מיקומו של ORFs שנבחרו על ההפניה DNA שנבחנה ללא צורך עוד ניתוחים נרחב או מאמץ ניסיוני.

Domainome ספריות ניתן להעביר לתוך הקשר הנבחר, המשמש כמכשיר האוניברסלי לביצוע מחקרים פונקציונלי. תפוקה גבוהה חלבון ביטוי ואינטראקציה ניתוח הפלטפורמה כי אנו משולב, כי קראנו Interactome-Seq מנצל הטכנולוגיה התצוגה phage על-ידי העברת את ORF מסוננים לתוך וקטור phagemid ויצירת phage-ORF ספריה. פעם מחדש משובטים לתוך הקשר התצוגה phage חלבון תחומים מוצגים על-פני M13 חלקיקים; בדרך זו domainome ספריות ניתן לבחור ישירות עבור ג’ין שברי קידוד תחומים עם פעילויות אנזימטיות ספציפיות או מחייב מאפיינים, ומאפשר רשתות interactome פרופיל. גישה זו תוארה לראשונה על ידי. Zacchi et al. ¹⁶ ומאוחר יותר השתמש בכמה אחרים בהקשר^13,17,18.

לעומת טכנולוגיות אחרות המשמשות ללימוד אינטראקציית חלבון-חלבון (כולל מערכת היברידית שני שמרים ספקטרומטר מסה^19,20), אחד היתרונות העיקריים היא ההגברה של הזוג איגוד המתרחשת במהלך phage הצגת מספר סיבובים של בחירה. זה מגביר את הרגישות הבחירה ובכך מאפשר הזיהוי תחומים של איגוד בשפע נמוך חלבונים קיים בספריה. היעילות של הבחירה ביצע עם ספריה ORF-מסוננים הוא גדל עוד יותר בשל היעדר שיבוטים פונקציונלי. בסופו של דבר, הטכנולוגיה מאפשרת את הבחירה לבצע נגד חלבון והן הלא-חלבון פיתיונות^{21,22,23,24,25}.

בחירות phage בעזרת הספריה domainome-phage יכול להתבצע באמצעות נוגדנים מגיע סרה של חולים עם מצבים פתולוגיים שונים, למשל מחלות אוטואימוניות¹³, סרטן או זיהום מחלות כפיתיון. גישה זו משמשת כדי להשיג שנקרא “נוגדנים החתימה” של המחלה שנבחנה המאפשר לזהות ולאפיין את אנטיגנים/epitopes במיוחד המוכרות נוגדנים של החולים במקביל בנפט. לעומת שיטות אחרות השימוש של phage התצוגה מאפשר זיהוי epitopes antigenic ליניאריות ולא הסתגלותי. הזיהוי של חתימה ספציפי יכול להיות פוטנציאל השפעה חשובה ההבנה פתוגנזה, עיצוב חיסון חדש, זיהוי של מטרות טיפוליות חדשות ופיתוח של כלי האבחון, prognostic חדשה וספציפי. יתר על כן, כאשר המחקר מתמקדת מחלות זיהומיות, היתרון העיקרי הוא הגילוי של חלבונים immunogenic הוא עצמאי מטיפוח הפתוגן.

הגישה שלנו מאשרת כי הכתבים מתקפלים יכולים לשמש בקנה מידה גנומית כדי לבחור את “domainome”: אוסף של חלבון מקופל בצורה נכונה, ביטוי טוב, מסיסים תחומים מחלק קידוד ה-DNA ו/או cDNA מכל יצור. פעם מבודד שברי חלבון שימושיים למטרות רבות, מתן מידע נסיוני חיוני עבור ג’ין ביאור גם לגבי לימודי המבנית, נוגדן epitope מיפוי, זיהוי אנטיגן, וכו ‘. שלמות התרגום של תפוקה גבוהה נתונים שסופקו על-ידי הגדרות המאפשרת הניתוח של דגימות מאוד מורכבים, כגון ספריות התצוגה phage, ומחזיק את היכולת לעקוף האיסוף מפרך מסורתי ובדיקות של שיבוטים phage בודדים שניצלו.

באותו הזמן בזכות התכונות של הספריה מסוננים וכדי את רגישות קיצונית והכוח של ניתוח המיתרים, זה ניתן לזהות את התחום חלבון אחראי ישירות על המסך הראשוני, ללא צורך ליצור אינטראקציה ספריות נוספות עבור כל אחד מחויב חלבון. הגדרות מאפשר להשיג הגדרה מקיפה כל domainome של כל מקור התחלתי genic/גנומית ומאפשרת בכלי האינטרנט של ניתוח נתונים של הקניית ספציפי מאוד אפיון בשני כמותיים נקודת מבט של התחומים של interactome חלבונים.

Protocol

1. בניית הספרייה ORF (איור 1) הכנת הכנס ה-DNA הכנה קטעים מ- DNA סינטטיים או גנומית תמצית/DNA תוך שימוש בשיטות הרגילות26לטהר. קטע דנ א על ידי sonication. אם משתמש של sonicator סטנדרטי, בתור התחלה הצעה כללית עם פולסים s 30 ב- 100% כוח פלט.הערה: ט…

Representative Results

גישת הסינון הוא schematized באיור1. ניתן להשתמש בכל סוג של דנ א intronless. איור 1A החלק הראשון של הגישה סינון מיוצג: לאחר טעינה של ג’ל agarose או bioanalyzer, פיצול טוב של ה-DNA של הריבית מופיע כתם של קטעים עם התפלגות האורך בגודל הרצוי של לחץ דם 150-750. תמונת הנציגה ג’…

Discussion

הקמת ספרייה באיכות גבוהה המסוננות ORFs מגוונת מאוד הוא השלב הקריטי הראשון כל התהליך מאז זה ישפיע על כל השלבים הבאים של הצינור.

יתרון תכונה חשובה של השיטה שלנו היא כי כל מקור ה-DNA (intronless) (cDNA, הדנ א, ה-PCR נגזר או דנ א סינתטי) מתאים ספריית הבנייה. הפרמטר הראשון שצריך לקחת בחשבון הוא כ?…

Materials

Sonopuls  ultrasonic homogenizer	Bandelin	HD2070	or equivalent
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder	Thermo Scientific	SM0321	or equivalent
GeneRuler 1 kb DNA Ladder	Thermo Fisher Scientific	SM0311	or equivalent
Molecular Biology Agarose	BioRad	161-3102	or equivalent
Green Gel Plus	Fisher Molecular Biology	FS-GEL01	or equivalent
6x DNA Loading Dye	Thermo Fisher Scientific	R0611	or equivalent
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	or equivalent
Quick Blunting Kit	New England Biolabs	E1201S
NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit	Thermo Fisher Scientific	4368813
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs	S1420S	or equivalent
QIAquick PCR purification Kit	Qiagen	28104	or equivalent
EcoRV	New England Biolabs	R0195L
Antarctic Phosphatase	New England Biolabs	M0289S
T4 DNA Ligase	New England Biolabs	M0202T
Sodium Acetate 3M pH5.2	general lab supplier
Ethanol for molecular biology	Sigma-Aldrich	E7023	or equivalent
DH5aF' bacteria cells	Thermo Fisher Scientific
0,2 ml tubes	general lab supplier
1,5 ml tubes	general lab supplier
0,1 cm electroporation cuvettes	Biosigma	4905020
Electroporator 2510	Eppendorf
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y1003
Ampicillin sodium salt	Sigma-Aldrich	A9518
Chloramphenicol	Sigma-Aldrich	C0378
DreamTaq DNA Polymerase	Thermo Fisher Scientific	EP0702
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447S
96-well thermal cycler (with heated lid)	general lab supplier
150 mm plates	general lab supplier
100 mm plates	general lab supplier
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
BssHII	New England Biolabs	R0199L
NheI	New England Biolabs	R0131L
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27104	or equivalent
M13KO7 Helper Phage	GE Healthcare Life Sciences	27-1524-01
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus	Sigma-Aldrich	K1377
Polyethylene glycol (PEG)	Sigma-Aldrich	P5413
Sodium Cloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S3014
PBS	general lab supplier
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation	Thermo Fisher Scientific	10003D	or equivalent
MagnaRack Magnetic Separation Rack	Thermo Fisher Scientific	CS15000	or equivalent
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
Nonfat dried milk powder	EuroClone	EMR180500
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	Kapa Biosystems, Fisher Scientific	7958935001
AMPure XP beads	Agencourt, Beckman Coulter	A63881
Nextera XT dual Index  Primers	Illumina	FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004
MiSeq or Hiseq2500	Illumina
Spectrophotomer	Nanodrop
Agilent Bioanalyzer or TapeStation	Agilent
Forward PCR primer	general lab supplier		5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’
Reverse PCR primer	general lab supplier		5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’
Forward primer for NGS	general lab supplier		5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’;
Reverse primer for NGS	general lab supplier		5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’;