위하여-Seq: Domainome 라이브러리 건설, 유효성 검사 및 페이지 표시 및 다음 세대 시퀀싱 선택 프로토콜
Summary
설명 하는 프로토콜 건설, 특성화 및 DNA 소스에서 만든 “domainome” 라이브러리 (선택의 대상)에 대 한 선택 수 있습니다. 이것은 다른 기술을 결합 하 여 연구 파이프라인에 의해 달성: 파지 디스플레이, 접이식 기자와 다음 세대 시퀀싱 데이터 분석을 위한 웹 도구.
Abstract
접이식 기자는 쉽게 식별할 수 있는 고기, 항생제 내성, 단백질 또는 임의의 열려있는 독서 프레임을 접는 제대로 융합 될 때 그 접는 및 기능 손상 등으로 단백질. 우리는 어디, 사용 하 여 가장-1 β-lactamase (암 피 실린 저항을 부여 하는 효소) 게놈 규모, 우리 수 선택 잘못 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션 어떤 intronless 유전자의 DNA의 코딩 부분에서 전략을 개발 했습니다. 이 접근 방식, 소위 “domainome”에 의해 얻은 단백질 조각 잘 표현 하 고 수용 성, 구조/기능 연구에 대 한 적합 한 그들을 만드는 것입니다.
복제 페이지 디스플레이 시스템에 직접 “domainome”를 표시 함으로써, 우리 그것은 원하는 바인딩 속성 (예를 들어, 다른 단백질 또는 항 체), 특정 단백질 도메인 선택할 수 필수 제공 보였다가 유전자 주석 또는 항 원 확인. 에 대 한 실험 정보
새로운 차세대 시퀀싱 기술 (NGS)를 사용 하 여 선택한 polyclonal 인구에 가장 풍부한 클론의 id는 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로 라이브러리 자체의 다양성, 풍부 및 정확한 매핑을 선택한 조각의 각에 완전 한 정보를 제공 하도록 선택 출력 깊은 시퀀싱 분석을 소개 합니다. 여기에 제시 된 프로토콜 라이브러리 건설, 특성화 및 유효성 검사에 대 한 주요 단계를 보여줍니다.
Introduction
여기, 우리는 높은 처리량 방법 건설과 genic/게놈 시작 소스에서 접힌 및 수용 성 단백질 도메인의 라이브러리의 선택에 대 한 설명. 접근은 세 가지 다른 기술: 파지 디스플레이, 데이터 분석을 위한 접는 기자와 특정 웹 도구 다음 세대 시퀀싱 (NGS)의 사용. 식별 및 새로운 단백질/단백질 도메인의 주석, 알려진된 단백질의 구조 및 기능적 속성의 정의의 특성에 대 한 단백질 기반 연구의 많은 다른 컨텍스트에서 메서드를 사용할 수 있습니다. 단백질 상호 작용 네트워크입니다.
많은 관련 질문은 단백질 기반 연구에 여전히 존재 하 고 최적의 단백질 생산을 위한 방법의 개발은 조사의 여러 분야에 대 한 중요 한 필요. 예를 들어 간결한 하 고 진 핵 게놈1의 수천의 가용성에도 불구 하 고 코딩 된 단백질 및 펩 티 드의 직접 주석으로 상대 proteomes의 해당 지도 아직도 대부분의 유기 체에 대 한 누락 된. 완전 한 proteomes의 카탈로그는 도전 목표 시간 및 자원의 점에서 거 대 한 노력을 요구로 떠오르고 있다. 실험적인 주석에 대 한 황금 표준 남아 모든 오픈 독서 프레임 (ORFs)는 게놈의 소위 “ORFeome” 건물의 복제. 일반적으로 유전자 기능에 알려진된 활동의 관련된 유전자 상 동에 따라 할당 됩니다 하지만이 방식은 많은 잘못 된 주석 참조 데이터베이스2,3,4,의 존재로 인해 제대로 정확한 5. 또한, 심지어 식별 및 주석 된 단백질에 대 한 추가 연구는 풍요, 구조적 및 기능적 속성을 포함 하 여 다른 컨텍스트에서 식 패턴의 관점에서 특성을 달성 하는 데 필요한 뿐만 아니라 상호 작용 네트워크입니다.
또한, 이후 단백질 그들 각각의 다른 도메인으로 구성 된 특정 기능을 표시 하 고 다르게 단백질 기능에 기여 하 고, 연구 하 고 이러한 도메인의 정확한 정의 수 있습니다 더 포괄적인 그림을 모두 단일 유전자 전체 게놈 수준에서. 이 모든 필요한 정보를 만든다 단백질 기반 연구 다양 하 고 도전적인 분야를
이 관점에서 중요 한 기여 단백질 생산을 위한 공평 하 고 높은 처리량 방법으로 주어질 수 있었다. 그러나, 상당한 투자가 필요 하 고, 옆에 같은 방식의 성공 성/안정적인 단백질 구조를 생산 하는 능력에 의존 합니다. 이것은 주요 제한 요소 때문에 단백질의 약 30% 수 수 성공적으로 표현을 실험적으로 유용한6,,78될 충분 한 수준에서 생산 추정 되었다. 이 한계를 극복 하는 방법은 함께 개별 유전자의 겹치는 조각 표현을 제공 하는 다른 polypeptides를 생산 하기 위해 무작위로 파편이 된 DNA의 사용을 기반으로 합니다. 임의로 생성 된 DNA 파편의 단지 작은 백분율은 기능적 ORFs 동안 그들의 대다수 (그들의 순서 안에 정지 codons의 존재) 때문에 작동 하지 않습니다 또는 해제 자연 (원래 다른 프레임에 ORF)에 대 한 인코딩 생물학 의미 없이 polypeptides입니다.
이러한 모든 문제를 해결 하려면 우리의 그룹 게놈 규모9,10,,1112에서 사용할 수는 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼을 개발 했습니다. 이 플랫폼 통합 다음 방법: 1); 모든 유기 체에서 DNA의 코딩 부분에서 제대로 접힌된 단백질 도메인의 컬렉션을 선택 하는 방법 상호 작용;의 파트너를 선택 하기 위한 2) 살 균 소 전시 기술 완전히 특성화 연구 전체 위하여 식별 관심;의 클론을 NGS 3) 그리고 4) 간단 하 고 사용자 친화적인 방식으로 위하여 Seq 분석을 수행 하기 위해 어떤 생물 정보학 또는 프로그래밍 기술 없이 사용자에 대 한 데이터 분석을 위한 웹 도구.
이 플랫폼의 사용 조사;의 대안 전략에 비해 중요 한 장점을 제공합니다 위의 모든 방법은 완전히 편견, 높은 처리량 및 전체 게놈까지 단일 유전자에서 배열 하는 연구에 대 한 모듈입니다. 파이프라인의 첫 단계가 특징인 다음 깊이 NGS 연구에서 무작위로 파편이 된 DNA에서 도서관의 창조 이다. 이 라이브러리는 관심의 유전자/파편 periplasmic 공간 (즉, 초 지도자)으로 단백질 분 비에 대 한 신호 순서와 TEM1 β-lactamase 유전자 사이 복제는 설계 된 벡터를 사용 하 여 생성 됩니다. 융해 단백질 암 피 실린 저항 및 복제 조각 프레임 경우에 암 피 실린 압력 하에서 생존 능력 부여 됩니다 이러한 요소와 결과 융해 단백질은 제대로 접힌된10,13 14. 모든 클론 항생제 선택, 소위 “필터링 클론” 구조, ORFs, 그들 (80%)의 대다수는, 실제 유전자9에서 파생 됩니다. 또한,이 전략의 힘 모든 필터링 ORF 클론 제대로 접혀/수용 성 단백질/도메인15인코딩하는 발견에 있다. 많은 클론, 라이브러리 및 매핑 동일한 지역/도메인에 있는 다른 시작 지점 및 끝 지점을, 수용 성 제품에서 발생 가능성이 최소 조각의 편견, 단일 단계 식별 수 있습니다.
기술에 있는 더 개선 라이브러리 특성 NGS의 사용에 의해 제공 됩니다. 이 플랫폼의 조합을 데이터 분석에 대 한 특정 웹 도구 참조 DNA 더 광범위 한 분석 필요성 없이 연구에 중요 한 편견된 정보 선택한 ORFs의 위치와 정확한 뉴클레오티드 시퀀스에 제공 또는 실험적인 노력입니다.
Domainome 라이브러리 선택 컨텍스트로 전송 고 기능 연구를 수행 하는 범용 악기로 사용 될 수 있습니다. 높은 처리량 단백질 표현과 상호 작용 분석 플랫폼 우리가 통합을 우리 위하여 Seq 라는 활용 살 균 소 전시 기술 phagemid 벡터 필터링된 ORF 전송 및 살 균 소 ORF를 만드는 도서관입니다. 일단 단백질 도메인 M13 입자;의 표면에 표시 되는 페이지 디스플레이 컨텍스트를에 다시 복제 이 방법으로 domainome 라이브러리는 유전자 파편 특정 효소 활동 도메인 인코딩 또는 바인딩 속성을 위하여 네트워크 프로 파일링에 대 한 직접 선택할 수 있습니다. 이 방법은 처음 Zacchi 그 외 여러분 에 의해 기술 되었다 16 및 여러 가지 다른 컨텍스트13,,1718에서 나중에 사용.
(를 포함 하 여 효 모 2 잡종 시스템 및 질량 분석19,20) 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 하는 다른 기술에 비해, 하나의 주요 장점은 살 균 소 중 발생 하는 바인딩 파트너의 증폭 선택의 여러 라운드를 표시 합니다. 이 라이브러리에 있는 낮은 풍부한 바인딩 단백질 도메인의 식별 되므로 선택 감도 증가 합니다. ORF 필터 라이브러리를 사용 하 여 수행 하는 선택의 효율성은 비 기능 클론의 부재로 인해 더욱 증가 된다. 마지막으로, 기술 선택을 단백질과 비 단백질 미끼21,22,23,,2425에 대해 수행 될 수 있습니다.
Domainome-페이지 라이브러리를 사용 하 여 페이지 선택 미끼로 다른 병 적인 조건 환자, 예를 들어 면역 질환13, 암 또는 감염 질환의 혈 청에서 나오는 항 체를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 이 방법은 대규모 식별 하 고 특성 항 원/epitopes 구체적으로 동시에 환자의 항 체에 의해 인식 수 있도록 연구에서 질병의 소위 “항 체 서명”를 얻기 위해 사용 됩니다. 사용 하는 다른 방법에 비해 살 균 소의 디스플레이 선형 및 구조적 항 원 epitopes의 식별 수 있습니다. 특정 서명 식별 잠재적으로 이해 병 인, 새로운 백신 디자인, 새로운 치료 목표의 확인과 개발 도구의 새로운 및 특정 진단 및 예 후에 대 한 중요 한 영향을 미칠 수 있는. 또한, 연구는 전염 성 질병에 초점을 맞추고 때 주요 이점은 면역성 단백질의 발견은 병원 체 재배에서 독립 이다.
우리의 접근 방식은 접는 기자를 “domainome”를 선택 하는 게놈에 사용할 수 있는 확인: DNA의 코딩 부분에서 제대로 접혀, 잘 표현, 수용 성 단백질 도메인 어떤 유기 체에서 cDNA의 컬렉션. 일단 고립 된 단백질 조각을 유전자 주석 뿐만 구조 연구, 항 체 epitope 매핑, 항 원 확인, 등등에 대 한 필수적인 실험 정보를 제공 하는 많은 목적을 위해 유용 하다. NGS에서 제공 하는 높은 처리량 데이터의 완전성 살 균 소 전시 도서관, 등 매우 복잡 한 샘플의 분석을 가능 하 게 그리고 전통적인 힘 드는 따기 및 개별 페이지 구조 클론의 테스트 회피 가능성을 보유 하고있다.
기능 필터링 된 라이브러리의와 극단적인 감도 그리고 NGS 분석의 힘을 동시에 만들 필요 없이 초기 화면에서 직접 각 상호 작용의 책임 단백질 도메인 식별 가능 하다 각 추가 라이브러리 바인딩 단백질. NGS genic/게놈 시작 소스 전체 domainome의 포괄적인 정의를 허용 하 고 데이터 분석 웹 도구는 매우 구체적인 특성 모두는 질적, 양적 관점에서의 획득은 위하여 단백질의 도메인입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
높은 품질 높은 다양 한 ORFs 필터링 된 도서관의 창조 때문에 파이프라인의 모든 이후 단계에 영향을 미칠 것입니다 전체 절차의 첫 번째 중요 한 단계입니다.
우리의 방법의 중요 한 유리한 기능 (intronless) DNA (cDNA, genomic DNA, PCR 파생 이나 합성 DNA)의 모든 소스 라이브러리 건설에 적합 이다. 고려 되어야 하는 첫 번째 매개 변수는 pFILTER 벡터에 복제 하는 DNA 파편의 길이 게놈 또…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 이탈리아 교육부 및 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (CP에 2010P3S8BR_002).
Materials
| Sonopuls ultrasonic homogenizer | Bandelin | HD2070 | or equivalent |
| GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | or equivalent |
| GeneRuler 1 kb DNA Ladder | Thermo Fisher Scientific | SM0311 | or equivalent |
| Molecular Biology Agarose | BioRad | 161-3102 | or equivalent |
| Green Gel Plus | Fisher Molecular Biology | FS-GEL01 | or equivalent |
| 6x DNA Loading Dye | Thermo Fisher Scientific | R0611 | or equivalent |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | or equivalent |
| Quick Blunting Kit | New England Biolabs | E1201S | |
| NanoDrop 2000 UV-Vis Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | or equivalent |
| QIAquick PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | or equivalent |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195L | |
| Antarctic Phosphatase | New England Biolabs | M0289S | |
| T4 DNA Ligase | New England Biolabs | M0202T | |
| Sodium Acetate 3M pH5.2 | general lab supplier | ||
| Ethanol for molecular biology | Sigma-Aldrich | E7023 | or equivalent |
| DH5aF' bacteria cells | Thermo Fisher Scientific | ||
| 0,2 ml tubes | general lab supplier | ||
| 1,5 ml tubes | general lab supplier | ||
| 0,1 cm electroporation cuvettes | Biosigma | 4905020 | |
| Electroporator 2510 | Eppendorf | ||
| 2x YT medium | Sigma-Aldrich | Y1003 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | Thermo Fisher Scientific | EP0702 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix | New England Biolabs | N0447S | |
| 96-well thermal cycler (with heated lid) | general lab supplier | ||
| 150 mm plates | general lab supplier | ||
| 100 mm plates | general lab supplier | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| BssHII | New England Biolabs | R0199L | |
| NheI | New England Biolabs | R0131L | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | or equivalent |
| M13KO7 Helper Phage | GE Healthcare Life Sciences | 27-1524-01 | |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K1377 | |
| Polyethylene glycol (PEG) | Sigma-Aldrich | P5413 | |
| Sodium Cloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| PBS | general lab supplier | ||
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10003D | or equivalent |
| MagnaRack Magnetic Separation Rack | Thermo Fisher Scientific | CS15000 | or equivalent |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Nonfat dried milk powder | EuroClone | EMR180500 | |
| KAPA HiFi HotStart ReadyMix | Kapa Biosystems, Fisher Scientific | 7958935001 | |
| AMPure XP beads | Agencourt, Beckman Coulter | A63881 | |
| Nextera XT dual Index Primers | Illumina | FC-131-2001 or FC-131-2002 or FC-131-2003 or FC-131-2004 | |
| MiSeq or Hiseq2500 | Illumina | ||
| Spectrophotomer | Nanodrop | ||
| Agilent Bioanalyzer or TapeStation | Agilent | ||
| Forward PCR primer | general lab supplier | 5’ TACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGATTGTTATTACTC 3’ | |
| Reverse PCR primer | general lab supplier | 5’ TGGTGATGGTGAGTACTATCCAGGCCCAGCAGTGGGTTTG 3’ | |
| Forward primer for NGS | general lab supplier | 5’ TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCAGCAAGCGGCGCGCATGC 3’; | |
| Reverse primer for NGS | general lab supplier | 5’ GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTGGTTTGCCGCTAGC 3’; |
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