胰腺胰岛与小鼠分离的简单高效协议
Summary
此胰岛分离方案描述了胶原酶注射以消化外分子组织的新途径，以及从小鼠中纯化胰岛的简化梯度程序。它涉及酶消化，梯度分离/纯化，和小岛手工采摘。成功的隔离可以产生250~350个高质量和全功能的小岛每只鼠标。
Abstract
胰腺胰岛，也称为兰格汉斯岛，是一组内分泌细胞，产生用于葡萄糖调节和其他重要生物功能的激素。胰岛主要由五种类型的激素分泌细胞组成：β细胞分泌胰高血糖素，β细胞分泌胰岛素，β细胞分泌生长激素，β细胞分泌ghrelin，PP细胞分泌胰腺多肽。胰岛中60%至80%的细胞是β细胞，这是研究胰岛素分泌的最重要细胞群。胰腺胰岛是研究体外胰岛素分泌的重要模型系统。获得高质量的胰岛对糖尿病研究具有重要意义。大多数小岛分离程序需要技术上难以进入胶原酶注射部位、苛刻和复杂的消化程序以及多个密度梯度纯化步骤。本文采用一种简单的高产小鼠胰岛隔离方法，具有详细的描述和真实的演示，显示了以下具体步骤：1）在Vater的ampulla注射胶原酶P，一个连接胰腺导管的小区域，常见的胆管，2）酶消化和机械分离的外分子胰腺，和3）单梯度纯化步骤。这种方法的优点是使用更易访问的 Vater ampulla 注射消化酶，使用酶和机械方法的组合进行更完整的消化，以及更简单的单梯度纯化步骤。该协议每只鼠标产生大约 250-350 个小岛;和小岛适合各种活体研究。此过程的可能警告是由于酶消化和/或长时间的梯度孵育而可能损坏的小岛，所有这些可以通过仔细说明孵育时间来避免。
Introduction
文献中有两种常见的胰岛隔离方法。一个要求切除胰腺，并用手术剪刀切成小块，然后消化在胶原酶溶液1，2，3。另一种更精确的方法是使用胰腺中的导管网络来引入消化酶。以下部位已用于消化酶注射：胆汁和囊性导管的结点，胆囊进入普通胆管，或普通胆管本身1，4，5。众所周知，胰岛在胰腺中分布不均匀;脾功能区域包含最多的胰岛6。虽然第二种方法使用解剖途径提供消化酶允许更完整的灌注胰腺，包括脾科区域，但此过程通常需要夹紧或缝合从技术上讲的 Vater 的 ampulla挑战。在胰岛纯化方面，使用多密度梯度以及细胞滤网和磁缩器来纯化胰岛3、7。这些梯度的利用可能非常耗时，而菲科尔梯度可能导致小岛8的毒性损伤。
目前的协议是建立在李等人描述的方法之上的，根据我们自己和其他人的经验，增加了额外的修改。我们协议最关键的步骤是夹紧靠近肝端的普通胆管，通过Vater的ampulla注射胶原酶P来消化外分明组织，然后用摇动的水浴以机械方式加速消化1。 4，7.随后，应用”STOP”溶液抑制胰岛的进一步消化;HBSS 用于洗掉剩余的胶原酶 P 和 STOP 溶液。当Ficoll方法用于纯化人类胰岛时，据报道，与使用Percoll梯度9相比，具有更大功能能力（例如胰岛素分泌）的胰岛的产量是两倍。然而，研究已经质疑使用菲科尔梯度，由于其毒性作用的小岛1，10。据介绍，Histopaque梯度为小鼠胰岛隔离提供了最佳的纯化动力学，具有更简单的步骤和更低的成本，可产生高质量的胰岛的良好产量。在我们的协议中，Histopaque-1077用于从其他残余组织8，11中纯化胰岛。收获的小岛可以在完整的RPMI-1640培养基培养，或直接用于RNA/蛋白质定量。
我们的协议，使用胶原酶P消化和单梯度纯化步骤的组合，比其他已公布的协议更简单。我们的方法不需要苛刻的外科手术，只有几个简单的步骤。更重要的是，正如我们报道的12中那样，该协议始终能产生高质量的功能胰岛（250-350/鼠标）的良好产量。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议包括胶原酶灌注和消化，然后是胰岛纯化。该协议最关键的步骤是有效的注射和完全灌注胰腺1，4，7。该协议的传递方法允许酶穿过解剖途径，以更好地消化胰岛1周围的外分子组织。此外，该技术非常适合完全消化脾功能区域，其中胰岛浓度最高，为4，6。?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们非常感谢詹妮弗·蒙吉亚女士对原理图的艺术插图。我们感谢休斯敦社区公共广播电台KPFT的迈克尔·霍尼格先生的编辑协助。这项研究得到了美国糖尿病协会#1-15-BS-177（YS）和NIH R56DK118334/R01DK118334（YS）的支持。这项工作还得到了美国农业部国家粮食和农业研究所、Hatch项目1010840（YS）和R01 DK095118（SG）的支持。
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Riferimenti
- Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biological Procedures Online. 11, 3-31 (2009).
- Gotoh, M., Maki, T., Kiyoizumi, T., Satomi, S., Monaco, A. An improved method for isolation of mouse pancreatic islets. Transplantation. 40 (4), 437-438 (1985).
- O’Dowd, J. F. The isolation and purification of rodent pancreatic islets of Langerhans. Methods in Molecular Biology. 560, 37-42 (2009).
- Do, O. H., Low, J. T., Thorn, P. Lepr(db) mouse model of type 2 diabetes: pancreatic islet isolation and live-cell 2-photon imaging of intact islets. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (99), e52632 (2015).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse islet of Langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (67), (2012).
- Wang, X. Regional Differences in Islet Distribution in the Human Pancreas – Preferential Beta-Cell Loss in the Head Region in Patients with Type 2 Diabetes. PLOS ONE. 8, (2013).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (88), e50374 (2014).
- Scharp, D. W., Lacy, P. E., Finke, E., Olack, B. Low-temperature culture of human islets isolated by the distention method and purified with Ficoll or Percoll gradients. Surgery. 107 (5), e50374 (1987).
- Salvalaggio, P. R. Islet filtration: a simple and rapid new purification procedure that avoids ficoll and improves islet mass and function. Transplantation. 74 (66), 877-879 (2002).
- Saliba, Y., Bakhos, J. J., Itani, T., Fares, N. An optimized protocol for purification of functional islets of Langerhans. Laboratory Investigation. 97 (1), 70-83 (2017).
- Pradhan, G., et al. Obestatin stimulates glucose-induced insulin secretion through ghrelin receptor GHS-R. Scientific Reports. 7 (1), 979 (2017).
- Shapiro, A. M. J., Hao, E., Rajotte, R. V., Kneteman, N. M. High yield of rodent islets with intraductal collagenase and stationary digestion–a comparison with standard technique. Cell Transplantation. 5 (6), 631-638 (1996).
