Un semplice protocollo ad alta efficienza per l'isolamento delle isolozioni pancreatiche dai topi
Summary
Questo protocollo di isolamento dell’isolotto ha descritto una nuova via di iniezione di collagenasi per digerire il tessuto esocrino e una procedura di gradiente semplificata per purificare le isole dai topi. Si tratta di digestione ezimatica, separazione/purificazione del gradiente e raccolta a mano dell’isolotto. Il successo dell’isolamento può produrre 250-350 isolotti di alta qualità e completamente funzionali per mouse.
Abstract
Le isole pancreatiche, chiamate anche isole di Langerhans, sono un gruppo di cellule endocrine che produce ormoni per la regolazione del glucosio e altre importanti funzioni biologiche. Le isole sono costituite principalmente da cinque tipi di cellule che secernono l’ormone: le cellule secernono glucagone, le cellule secernono insulina, cellule che sortostatine, le cellule secernono la grelina e le cellule PP secernono la polipeptide pancreatica. Il sessanta-80% delle cellule nelle isole sono cellule z, che sono la popolazione cellulare più importante per studiare la secrezione di insulina. Le isole pancreatiche sono un sistema modello cruciale per studiare la secrezione di insulina ex vivo. Acquisire isocchi di alta qualità è di grande importanza per la ricerca sul diabete. La maggior parte delle procedure di isolamento dell’isolotto richiedono tecnicamente difficile accedere al sito di iniezione di collagenase, procedure di digestione dure e complesse e più fasi di purificazione del gradiente di densità. Questo documento presenta un semplice metodo di isolamento dell’isolotto del mouse ad alto rendimento con descrizioni dettagliate e dimostrazioni realistiche, che mostra i seguenti passaggi specifici: 1) iniezione di collagene P all’ampulla di Vater, una piccola area che unisce il condotto pancreatico e il dotto biliare comune, 2) la digestione enzimatica e la separazione meccanica del pancreas esocrino, e 3) un singolo passo di purificazione del gradiente. I vantaggi di questo metodo sono l’iniezione di enzima digestivo utilizzando l’ampulla più accessibile di Vater, una digestione più completa utilizzando la combinazione di approcci enzimatici e meccanici e una fase di purificazione a singolo gradiente più semplice. Questo protocollo produce circa 250-350 isolotti per mouse; e isolotti sono adatti per vari studi ex vivo. Possibili avvertenze di questa procedura sono potenzialmente danneggiate isole a causa di digestione enzimatica e/o incubazione del gradiente prolungata, che possono essere evitati in gran parte con un’attenta giustificazione pubblicitaria del tempo di incubazione.
Introduction
Ci sono due metodi comuni nella letteratura per l’isolamento delle isolotzioni pancreatiche. Uno richiede di eccitare il pancreas e dividerlo in piccoli pezzi usando forbici chirurgiche, e poi digerirlo in una soluzione collagenae1,2,3. Un altro metodo più preciso è quello di utilizzare la rete di dotti presenti nel pancreas per introdurre l’enzima digestivo. I seguenti siti sono stati utilizzati per l’iniezione di enzimi digestivi: la giunzione della bile e del dotto cistico, la cistifellea nel dotto biliare comune, o il dotto biliare comune stesso1,4,5. È noto che le isole non sono distribuite uniformemente nel pancreas; la regione splenica contiene la maggior parte degli isolotti6. Mentre il secondo metodo che utilizza percorsi anatomici per fornire enzimi digestivi consente una perfusione più completa del pancreas, compresa la regione splenica, questa procedura spesso richiede la bloccallatura o la sutura dell’ampulla del Vater tecnicamente impegnativo. In termini di purificazione dell’isolotto, sono stati utilizzati ceppi di densità multipla, così come ceppi cellulari e retrazione magnetica per purificare le isole3,7. L’utilizzo di questi gradienti può richiedere molto tempo e le pendenze Ficoll possono causare danni tossici alle isole8.
Il protocollo attuale si basa sul metodo descritto da Li et al.7, con ulteriori modifiche aggiunte in base all’esperienza di noi stessi e degli altri1,4. I passaggi più critici del nostro protocollo sono il bloccaggio del dotto biliare comune vicino alla fine del fegato, l’iniezione di collagenasi P attraverso l’ampulla di Vater per digerire il tessuto esocrino, e quindi utilizzando un bagno d’acqua accomodante per accelerare la digestione meccanicamente1, 4,7. Successivamente, viene applicata una soluzione “STOP” per inibire un’ulteriore digestione delle isole; HBSS viene utilizzato per lavare via la restante soluzione collagenasi P e STOP. Quando il metodo Ficoll è stato utilizzato per purificare le isole umane, la resa è stata segnalata per essere due volte le isole con maggiore capacità funzionale (ad esempio, secrezione di insulina) rispetto all’uso di gradienti di Percoll9. Tuttavia, gli studi hanno messo in discussione l’uso del gradiente di Ficoll a causa del suo effetto tossico sulle isole1,10. È stato riferito che il gradiente Histopaque fornisce una cinetica di purificazione ottimale per l’isolamento dell’isolotto del mouse, che produce una buona resa di isolotti di alta qualità con passaggi più semplici e costi inferiori1. Nel nostro protocollo, Histopaque-1077 viene utilizzato per purificare le isole da altri tessuti residui8,11. Le isole raccolte possono essere coltivate in supporti RPMI-1640 completi, o utilizzati direttamente nella quantificazione RNA/proteina.
Il nostro protocollo, utilizzando una combinazione di digestione di collageneP e una singola fase di purificazione del gradiente, è più semplice rispetto ad altri protocolli pubblicati. Il nostro metodo non richiede procedure chirurgiche impegnative e ha pochi semplici passi. Ancora più importante, questo protocollo produce costantemente una buona resa di isolotti funzionali di alta qualità (250-350/mouse) come abbiamo riportato12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo include la perfusione di collagenae e la digestione, seguita dalla purificazione delle isole. I passaggi più critici di questo protocollo sono l’iniezione efficace e la perfusione completa del pancreas1,4,7. Il metodo di consegna di questo protocollo permette all’enzima di attraversare le vie anatomiche per digerire meglio il tessuto esocrino che circonda le isole1. Inoltre, questa tecn…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo estremamente grati alla signora Jennifer Munguia per la sua illustrazione artistica del diagramma schematico. Ringraziamo il signor Michael R. Honig alla Community Public Radio Station KPFT di Houston per la sua assistenza editoriale. Questo studio è stato supportato dall’American Diabetes Association #1-15-BS-177 (YS) e NIH R56DK118334/R01DK118334 (YS). Questo lavoro è stato sostenuto anche dall’USDA National Institute of Food and Agriculture, progetto Hatch 1010840 (YS) e R01 DK095118 (SG).
Materials
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Hoding collagenase P |
| Coverglass forceps | VWR | 82027-396 | Holding skin of mouse to aid incision procedure |
| Curved forceps | Sigma-Aldrich | Z168696 | Holding tissues during pancreas removal |
| Isoflurane | Piramal | B13B16A | To anaesthetize mice prior surgery |
| 100 mm petri dishes | VWR | 30-2041 | Used for islet culture |
| 30 G. ½ inch needle | BD | 305106 | For penetration of Ampulla of vater to deliver Collagenase P – this guage is used as it fits well in most CBDs |
| 50ml tube | VWR | 89039-658 | Holding digested pancreatic tissue, collagenase P, and purified islets |
| Absorbent pads with waterproof moisture barrier | VWR | 82020-845 | To absorb blood from syurgical procesdudes |
| Centrifuge 5810R with swing bucket and deceleration capability | Eppendorf | 5811FJ478114 | Use for pelleting tissues, pellet is formed at bottom of conical tube – swing bucket centrifuge is needed. Also the decelaration feature is important to form the gradient layers. |
| Collagenase P- 1g | Roche Diagnostics | 11249002001 | For digestion of exocrine pancreas |
| Curved surgical scissors | Fisher-Scientific | 13-804-21 | For cutting open mouse abdomen |
| Dissection microscope | Olympus | SZX16 | Used for identification of key anatomical structures to accurately deliver collagenase into pancreas |
| Hank's Balanced Salt Solution 10x | Corning | 20-023-CV | Washing cells |
| Histopaque-1077 | Sigma | RNBF5100 | For gradient formation |
| Light source | Leeds | LR92240 | Enhancing visibility of microscope |
| RNaseZap | Fisher-Scientific | AM9780 | For removing RNase |
| RPMI-1640 Media w/o L-Glutamine | Corning | 15-040-CV | Culturing Islets |
| Schwartz micro serrefines (Microvascular clamp) | Fine Science Tools | 18052-01 | Clamping common bile duct and hepatic artery |
| Shaking waterbath | Boekel/Grant | 8R0534008 | Important for mechanical digestion of exocrine tissue |
| Small surgical scissors | VWR | 82027-578 | Cuttitng tissue that atached to pancreas |
Riferimenti
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