यहां वर्णित प्रोटोकॉल आलू (मकोय tuberosum) के कंद के भीतर endoreduplication को मापने के लिए एक विधि है । यह बहाव प्रवाह cytometric विश्लेषण में शोर और मलबे को कम करने के लिए plasmolysis और protoplast निष्कर्षण कदम भी शामिल है ।
Endoreduplication, बाद में cytokinesis बिना एक सेल के परमाणु जीनोम की प्रतिकृति, वृद्धि की डीएनए सामग्री के साथ पैदावार कोशिकाओं और विशेषज्ञता, विकास और सेलुलर आकार में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है । पौधों में, endoreduplication कुछ ऊतकों और अंगों के विकास और विस्तार की सुविधा के लिए लगता है । इनमें आलू की कंद (मकोय tuberosum) है, जो कार्बोहाइड्रेट भंडारण के अपने कार्य को पूरा करने में काफी सेलुलर विस्तार है । इस प्रकार, endoreduplication कैसे कंद कार्बन की इस बहुतायत को समायोजित करने में सक्षम हैं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है । हालांकि, सेलुलर मलबे से कच्चे तेल का परमाणु अलगाव के परिणामस्वरूप, तरीकों कि पत्तियों के साथ प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया जा सकता है, precludes कंद endoreduplication सूचकांक (ेि) का आकलन । यह लेख protoplasts के अलगाव के माध्यम से कंद endoreduplication के आकलन के लिए एक तकनीक प्रस्तुत करता है, जबकि अलग पादी और compartmentalized कंद के ऊतकों से प्राप्त प्रतिनिधि परिणाम का प्रदर्शन । प्रोटोकॉल की प्रमुख सीमाएं समय और एजेंट नमूना तैयारी के लिए आवश्यक लागत के रूप में के रूप में अच्छी तरह से नमूनों की अपेक्षाकृत कम उंर protoplasts के lysis के बाद कर रहे हैं । जबकि प्रोटोकॉल तकनीकी भिंनता के प्रति संवेदनशील है, यह इन बड़े विशिष्ट कोशिकाओं से परमाणु अलगाव के पारंपरिक तरीकों पर एक सुधार का प्रतिनिधित्व करता है । ऐसे रीसाइक्लिंग एंजाइम के रूप में प्रोटोकॉल के लिए सुधार के लिए संभावनाओं, fixatives के उपयोग, और अंय परिवर्तन का प्रस्ताव कर रहे हैं ।
Endoreduplication प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक सेल विशिष्ट कोशिका चक्र forgoes है और इसके बजाय सेलुलर विभाजन के बिना डीएनए प्रतिकृति के दोहराया दौर से मिलकर विकास का एक वैकल्पिक पाठ्यक्रम से गुजरती है । परिणामस्वरूप कोशिका डीएनए सामग्री और परमाणु आकार में वृद्धि हुई है जो सेलुलर विनियमन, विस्तार, और विशेषज्ञता में एक भूमिका निभाने के लिए सोचा है होगा । आम तौर पर, endoreduplication के एक दौर (एक endocycle) और डीएनए सामग्री में इसी वृद्धि के साथ जुड़े रहे है बड़ा सेल मात्रा, एक प्रेक्षण है कि उपजी “karyoplasmic सिद्धांत” है कि वृद्धि की डीएनए सामग्री के लिए ठीक से आवश्यक है एक बड़ा, शायद अधिक जटिल, सेल1विनियमन । यह घटना उच्च पौधों में आम है, संरचनात्मक/रक्षात्मक (trichomes) के साथ उन सहित ऊतकों की एक श्रेणी में मनाया गया है2,3, पोषक (मक्का endosperm)4,5, और सिंक/ टोमॅटो बोड़ी; आलू कंद)6,7,8 कार्य । फलों में, यह सुझाव दिया गया है कि endoreduplication endoreduplication और फल विकासात्मक अवधि के बीच नकारात्मक संबंध के रूप में सबूत के रूप में बोड़ी के तेजी से विस्तार को सुविधाजनक बनाने में एक भूमिका निभाता है9. उदाहरण के लिए डीएनए सामग्री के साथ कोशिकाओं 512C करने के लिए (512 गुना अगुणित जीनोम) टमाटर बोड़ी में मनाया गया है8। इसके अलावा Chevalier एट अल (2014) का प्रदर्शन किया है कि सेल चक्र जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन बोड़ी जो बड़ा फल10में परिणाम के भीतर endoreduplication के स्तर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, endoreduplication को बढ़ावा देने के जीन के परिवर्तन बायोमास या संयंत्र प्रजनन या आनुवंशिक हेरफेर के माध्यम से उपज के सुधार के लिए एक संभावित लक्ष्य प्रदान करता है । हालांकि, इस तरह के सुधार के कारणों और endoreduplication के परिणामों की अधिक से अधिक समझ पर आकस्मिक है ।
Endoreduplication सबसे अधिक बार प्रवाह cytometry जिससे नाभिक, क्रूड ऊतक तैयारी11में जारी द्वारा मापा जाता है, ऐसे propidium आयोडाइड12 (PI) के रूप में एक डीएनए बाध्यकारी fluorophore, के साथ तैयार कर रहे हैं । फ़िल्टर किए गए नमूनों तो एक प्रवाह cytometer के लेजर द्वारा पारित कर रहे हैं, जहां उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य fluorophore के लिए विशिष्ट देखा जा सकता है । प्रत्येक घटना (यानी, नाभिक) में प्रतिदीप्ति की तीव्रता सीधे-कण के डीएनए-सामग्री से संबंधित है । इस प्रकार, एक ज्ञात मानक की तुलना करके, रिश्तेदार और एक दिए गए नमूने में कोशिकाओं की पूर्ण डीएनए सामग्री की गणना की जा सकती है । Endoreduplication सूचकांक (ेि) सेलुलर डीएनए सामग्री (सी-वैल्यू) को देख कर एक नमूने के भीतर प्रति कोशिका endocycles की औसत संख्या स्थापित करने के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं जहां 1C एक अगुणित सेल के डीएनए सामग्री है (सूत्र प्रोटोकॉल के चरण 6.7 में प्रस्तुत). उदाहरण के लिए, एक द्विगुणित जीव में, दैहिक कोशिकाओं के आधार डीएनए सामग्री 2c है । यदि किसी नमूने में कुछ कक्ष है 4c के साथ, endoreduplication के एक एकल दौर के लिए संगत, या अधिक यह 0 के पास एक ेि होगा; लेकिन अगर लगभग सभी कोशिकाओं को 4c है 1 लगभग होगा । हालांकि, के रूप में endoreduplication के कई दौर उच्च पौधों में आम है देखा ेि मूल्यों बहुत अधिक हो सकता है । जबकि endoreduplication सूचकांक की गणना अपेक्षाकृत सरल हो सकता है, यह आवश्यक है कि नाभिक सी के सापेक्ष बहुतायत-मूल्यों मज़बूती से पता लगाया है, जो कुछ प्रजातियों और ऊतकों (आलू कंद सहित) में precluded है । यह संभावना है कि सेलुलर शरीर रचना विज्ञान, रसायन विज्ञान या कोशिका दीवार संरचना में अंतर13 इन नमूनों के कारण ठेठ एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग करने के लिए उचित बफ़र्स कि सामांयतः उपयोग किया जाता है में नाभिक जारी तैयारी के लिए अड़ियल हो ऐसे टमाटर बोड़ी, endoreduplication अध्ययन8के लिए एक मॉडल के रूप में ऊतकों के साथ ।
आलू में, कंद के भीतर endoreduplication की परीक्षा सिर्फ एक जोड़े के अध्ययन तक ही सीमित रहता है, शायद aforementioned कच्चे तेल की तैयारी के रूप में एक विश्वसनीय प्रोटोकॉल की कमी के कारण भाग में असंगत परिणाम उपज । जबकि ऐसे दृष्टिकोण पत्तियों के लिए अच्छी तरह से काम कंद के नमूने गंभीर क्षरण और मलबे के रूप में शोर की एक बहुतायत का अनुभव है, सी भिंन-मूल्यों के साथ नाभिक के शामिल चोटियों के भेदभाव लगभग असंभव बना । यह शायद सेलुलर संरचना में मतभेद और कंद कोशिकाओं के भीतर सेलुलर मलबे की एक फले के कारण है (उदास्टार्च-भंडारण amyloplasts) । इस बाधा को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में आलू कंद के प्रवाह cytometry में विशिष्ठ चोटियों को प्राप्त करने के लिए एक अधिक विश्वसनीय प्रोटोकॉल विकसित किया है । प्रत्येक चोटी के भीतर कोशिकाओं की आवृत्ति तो अलग पादी या एक कंद शामिल है कि विभिंन ऊतकों के लिए सटीक endoreduplication स्तरों की गणना के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रोटोकॉल, जो एक संशोधित protoplast निष्कर्षण विधि14रोजगार,15 पूर्वपद पहले वर्णित प्रवाह cytometry11, आलू रिश्तेदारों, किस्मों, और ऊतकों के भीतर काफी भिंनता दिखाया16 . यहाँ हम ploidy, ऊतक, और कंद के आकार के संदर्भों में ेि का मूल्यांकन करके विस्तार से प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
प्रोटोकॉल प्रस्तुत इस के साथ साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है एक के लिए आलू कंद, जिसका संशोधित सेलुलर सामग्री और सेल आकार प्रतीत होता है बाधा अंय प्रवाह cytometry की तैयारी के भीतर endoreduplication का आकलन करने का मतलब है । प्रोटोकॉल एक शोर और मलबे को कम करने के लिए जबकि परमाणु अखंडता को बनाए रखने के साधन के रूप में protoplast पीढ़ी पर निर्भर करता है । पहले, शोधकर्ताओं ने विशेष रूप से अड़ियल प्रवाह cytometry नमूनों के लिए इसी तरह की तैयारी का वर्णन किया है और साथ ही उपयोग कंद protoplasts रोगजनन19,20जैसे विषयों की एक किस्म का अध्ययन करने के लिए । हालांकि, हमारे ज्ञान के लिए, कोई भी endoreduplication अध्ययन के प्रयोजन के लिए प्रवाह cytometry के साथ इस तरह के कंद protoplasts के उपयोग संयुक्त है । इसके अलावा, हम protoplasts का उपयोग करने के लिए ठेठ कच्चे तेल की तैयारी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दो ही अंय अध्ययनों में उपयोग तकनीक को कंद endoreduplication6,7का आकलन करने से अधिक विश्वसनीय हो पाया । यहां हम प्रोटोकॉल की कमियों पर चर्चा, इसके निष्पादन और नमूना तैयारी में संभावित नुकसान, और एक ठेठ प्रयोग जो इसे रोजगार के परिणाम ।
उपयोगिता और कंद प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल की पुनरावृत्ति के बावजूद, यह कुछ कमजोरियों जो चर्चा की जानी चाहिए है । शुरू करने के लिए, प्रोटोकॉल समय गहन है, दो रात की गर्मी की आवश्यकता होती है । इसके अलावा, प्रोटोकॉल कुछ महंगा एजेंट, विशेष रूप से cellulase और macerozyme की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, तैयारियां अत्यधिक समय-संवेदी होती हैं, कुछ ही घंटों के भीतर अपमानजनक होती है, जो एक ही दिन के भीतर प्रवाह को सीमित कर सकती है, विशेषकर यदि कई घटनाएँ वांछित हों. अंत में, प्रोटोकॉल, जबकि विश्वसनीय, नमूना तैयारी के भीतर त्रुटियों के प्रति संवेदनशील है जो सभी के नाभिक और कम गुणवत्ता के परिणाम को नुकसान में परिणाम लगते हैं । उदाहरण के लिए, माइक्रोबियल संक्रमण plasmolysis और protoplast पीढ़ी कदम (1 – 3.4) अनुचित अपूतित तकनीक के कारण के दौरान हो सकता है । नमूना संदूषण, जबकि हमेशा नहीं एक नमूना की सफलता precluding, नाटकीय रूप से प्राप्त हिस्टोग्रामs की गुणवत्ता में कमी करने के लिए लगता है, फिर नाभिक को नुकसान की वजह से की संभावना है ।
जैसा कि पहले कहा गया है, प्रोटोकॉल की बड़ी कमियां लागत, समय, और त्रुटियों के प्रति संवेदनशीलता हैं । शोधकर्ताओं को इन में से प्रत्येक के लये कदम उठाने की इच्छा हो सकती है. लागत के लिए के रूप में, शोधकर्ताओं ने कई नमूनों के लिए प्रोटोकॉल लागू करने के लिए इच्छुक एंजाइम सांद्रता और/या पाचन कदम की अवधि के रूप में विभिंन ऊतकों और पादी जवाबदेही में भिंन हो सकते है संशोधित करने पर विचार कर सकते हैं । यह फ़िल्टरिंग और जो पहले से प्रदर्शन किया गया है, लेकिन यहां कार्यरत21नहीं रिसाइकिलिंग की संभावना भी शामिल है । समय के लिए के रूप में, हमारे प्रेक्षण में, यह पहली मशीन के साथ बांटना संभव है (plasmolysis कदम) और अभी भी protoplasts निकालने; हालांकि, उनकी अखंडता और बहुतायत है, जो नकारात्मक प्रभावों परिणाम भुगतना होगा । नमूनों की गिरावट को कम करने के लिए शोधकर्ताओं ने विचार कर सकते हैं कि कुछ प्रवाह cytometry दृष्टिकोण fixatives का उपयोग शामिल (जैसे, formaldehyde) नमूना अखंडता को संरक्षित करने के लिए22. यह दोनों गिरावट को रोकने के लिए एक उपयोगी साधन हो सकता है और प्रस्तुत के रूप में एक ही दिन पर होने वाली protoplast सटीक और प्रवाह cytometry के बजाय नमूना भंडारण के लिए अनुमति देते हैं । नाभिक के उदासीनता को रोकने का एक अंय साधन के लिए ES और/या FBC के लिए एक nuclease अवरोधक शामिल हो सकता है; जबकि 2-mercaptoethanol विकास के दौरान कोई ध्यान देने योग्य परिवर्तन प्रभावित, अंय अवरोधों यहां परीक्षण नहीं किया गया है ।
हमारे अवलोकन में, एक सबसे महत्वपूर्ण कदम चरण 4.4, प्रवाह cytometry बफर (FCB) के अलावा से पहले सभी plasmolysis धोने समाधान का निष्कासन है । यदि यहां तक कि एक छोटी मात्रा (< 10 µ l) बनी रहती है, तो नमूनों में ज्यादा नीचा होने की संभावना होती है जो गरीब या विफल नमूना का नेतृत्व कर सकते हैं । यह एंजाइम समाधान के भीतर अशुद्धियों के कारण होने की संभावना है (जैसे nucleases, teases)23,24 जो जल्दी से मशीन अवधि और नमूना रन के बीच समय के दौरान नाभिक नीचा, यहां तक कि कम सांद्रता पर. एक अंय महत्वपूर्ण विचार PI और RNase की अवधि के लिए गर्मी कदम है । के रूप में प्रोटोकॉल में उल्लेख किया है, नमूनों FCB के अलावा के बाद से अधिक कुछ घंटों के लिए स्थिर नहीं रहना है तो शोधकर्ताओं ने इन कदमों की अवधि को कम करने के लिए और अधिक नमूनों या लंबा प्रवाह cytometry कम नाभिक से जिसके परिणामस्वरूप चलाता को समायोजित करने का फैसला कर सकते हैं सांद्रता. यह भी शोधकर्ता के लिए नमूना और नमूनों की कुल संख्या प्रति घटनाओं की संख्या के बीच tradeoff पर विचार करने के लिए चलाने के लिए या पहले उल्लेख के रूप में fixatives के उपयोग पर विचार की आवश्यकता है ।
ऊतकों और पादी के बीच अंतर
प्रोटोकॉल के परिणाम प्रतिनिधि प्रदान करने के लिए हम दो सरल प्रयोगों ऊतक द्वारा पहले से सूचित भिंनता की पुष्टि करें और ploidy और जीनोटाइप के प्रभाव की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया । ऊतक प्रयोग के परिणामों को प्रदर्शित करता है कि प्रोटोकॉल reproducible परिणाम पैदावार, मज्जा ऊतक के रूप में एक बार फिर से सबसे अधिक पाया गया था । कुछ हद तक आश्चर्यजनक पैरेन्काइमा ऊतक, जो पहले से मूल्यांकन नहीं किया गया था, एक ेि cortical ऊतक के समान मूल्य था और काफी मज्जा से कम है । यह पैरेन्काइमा कोशिकाओं के रूप में अप्रत्याशित था आमतौर पर या तो मज्जा या cortical कोशिकाओं से भी बड़ा है, कम परिपक्वता पर । एक संभव विवरण है कि कंद (90-130 ग्राम) पैरेन्काइमा कोशिकाओं है, जो परिपक्वता पर कंद की मात्रा के बहुमत शामिल के लिए भी अपरिपक्व थे, पूरी तरह से विस्तार किया है और उनके अधिकतम सी-25मूल्यों तक पहुंच । यह भी समझा जा सकता है क्यों dihaploid (VT_SUP_19) और डबल dihaploid (VT_SUP_19 4x) काफी अधिक cv से अधिक ेि प्रदर्शन किया । बेहतर कंद; जबकि लगभग बराबर आकार के कंद प्रत्येक जीनोटाइप से नमूने लिए गए थे, या तो VT_SUP_19 या isogenic tetraploid से कंद का अधिकतम आकार जनक की तुलना में बहुत छोटा है । इस प्रकार, यह हो सकता है कि वे अधिक से अधिक ेि बस प्रदर्शित क्योंकि वे अपने अधिकतम प्राप्य आकार के सापेक्ष बड़े थे । वैकल्पिक रूप से, अंतर आनुवंशिक पूरक अपने tetraploid जनक से प्राप्त VT_SUP_19 का एक परिणाम हो सकता है । एक और संभावना है कि जीनोमिक कमी है कि tetraploid से dihaploid के निष्कर्षण पर हुआ बेपर्दा बचके alleles संयंत्र चौड़ा तनाव में जिसके परिणामस्वरूप हो सकता है, जो भी ऊंचा ेि में योगदान करने के लिए दिखाया गया है26। फिर भी, यह दर्शाता है सावधान विचार शोधकर्ताओं को काम करना चाहिए जब कंद और ऊतकों का चयन करने के लिए पादी के बीच विशेष रूप से, ेि मूल्यों की तुलना के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
भविष्य अनुप्रयोगों
इस लेख में वर्णित प्रोटोकॉल आलू में endoreduplication को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करता है । यह endoreduplication के आनुवंशिक और पर्यावरणीय घटकों में अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता है, कंद के ऊतकों में विकास का समय-पाठ्यक्रम, और प्राकृतिक भिन्नता का आकलन । अंततः, endoreduplication आलू सुधार, एक उपक्रम है जो आकलन के एक विश्वसनीय साधन की आवश्यकता होगी के लिए एक आशाजनक लक्ष्य बना सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
यह शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन पुरस्कार संख्या १२३७९६९ द्वारा वित्त पोषित किया गया था, “Heterozygosity, Allelic रचना, और आलू की प्रतिलिपि संख्या भिन्नता” और USDA विशेष अनुदान 2014-34141-22266 (मेन के विश्वविद्यालय) आर. वी.
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |