El protocolo descrito aquí es un método para medir la endorreduplicación en tubérculos de papa (Solanum tuberosum). Incluye plasmólisis y protoplasto pasos de extracción para disminuir el ruido y la suciedad en análisis cytometric del flujo aguas abajo.
Endorreduplicación, la replicación del genoma nuclear de la célula sin citocinesis posterior, produce células con mayor contenido de ADN y se asocia con la especialización, desarrollo y aumento de tamaño celular. En las plantas, endoreduplication parece facilitar el crecimiento y expansión de ciertos tejidos y órganos. Entre ellos se encuentra el tubérculo de papa (Solanum tuberosum), que se somete a expansión celular considerable en el cumplimiento de su función de almacenamiento de hidratos de carbono. Por lo tanto, endorreduplicación puede jugar un papel importante en cómo los tubérculos son capaces de dar cabida a esta abundancia de carbono. Sin embargo, los desechos celulares resultantes de los métodos de aislamiento nuclear crudo de tubérculos, métodos que pueden utilizarse eficazmente con las hojas, impide la estimación del índice de endorreduplicación de tubérculo (IE). Este artículo presenta una técnica para evaluar la endorreduplicación del tubérculo por el aislamiento de protoplastos y demostrando resultados representativos obtenidos de diferentes genotipos compartimentados los tejidos del tubérculo. Las limitaciones principales del protocolo son los costos de tiempo y reactivos necesarios para la preparación de la muestra así como la relativamente corta vida útil de las muestras después de lisis de los protoplastos. Mientras que el protocolo es sensible a la variación técnica, representa una mejora sobre los métodos tradicionales de aislamiento nuclear de estas grandes células especializadas. Se proponen posibilidades de mejoras en el protocolo como reciclaje de enzima, el uso de fijadores y otras alteraciones.
Endorreduplicación es el proceso por el cual una célula renuncia a ciclo celular típico y en cambio somete a un curso alternativo de desarrollo que consiste en reiteradas rondas de replicación de ADN sin división celular. La célula resultante habrá aumentado DNA tamaño contenido y nuclear que se cree que desempeñan un papel en la regulación celular, la expansión y especialización. Generalmente, una ronda de endorreduplicación (llamado un endocycle) y el correspondiente aumento en contenido de ADN se asocian con mayor volumen de la célula, una observación que precipitó la “teoría karyoplasmic” que incrementó el contenido de ADN es necesaria para bien regular un más grande, tal vez más complejo, celda1. Este fenómeno es común en las plantas superiores, que se ha observado en una amplia gama de tejidos, incluyendo los estructurales/defensivo (tricomas)2,3, nutritivo (endospermo de maíz)4,5y (fregadero/almacenamiento pericarpio de tomate; funciones de tubérculo de patata)6,7,8 . En la fruta, se ha sugerido que eso endoreduplication desempeña un papel en facilitar la rápida expansión del pericarpio evidenciada por la relación negativa entre la endorreduplicación y fruto del desarrollo período9. Por ejemplo células con contenido hasta C 512 (512 veces el genoma haploide) se han observado en el pericarpio de tomate8de ADN. Además Chevalier et al (2014) demostró que alteraciones en la expresión de genes del ciclo celular pueden conducir a aumentos en niveles de endorreduplicación dentro del pericarpio que entonces se traduce en frutas más grandes10. Así, alteración de genes promoviendo endoreduplication proporciona una diana potencial para la mejora de la biomasa o la producción a través de fitomejoramiento o manipulación genética. Sin embargo, tal mejora está condicionada a una mayor comprensión de las causas y consecuencias de la endorreduplicación.
Endorreduplicación más a menudo se mide por citometría de flujo por el núcleo, en preparaciones de tejido crudo11, se incuba con un fluoróforo de unión al ADN, tales como yoduro de propidio12 (PI). Las muestras filtradas pasan luego por el láser de un citómetro de flujo donde se pueden observar longitudes de onda de emisión específicos para el fluoróforo. La intensidad de fluorescencia en cada caso (es decir, núcleo) está directamente relacionada con el contenido de ADN de la partícula. Así, por comparación con un estándar conocido, puede calcularse el contenido de ADN relativo y absoluto de las células en una muestra determinada. Índices de endorreduplicación (IE) se determinan estableciendo el número promedio de endocycles por la célula dentro de una muestra, observando el contenido celular de ADN (valor C) donde C 1 es el contenido de ADN de una célula haploide (fórmula presentada en el paso 6.7 del Protocolo). Por ejemplo, en un organismo diploide, el contenido base de ADN de las células somáticas es 2C. Si una muestra tiene algunas células con 4C, correspondiente a una sola ronda de endorreduplicación, o mayor tendría un EI cerca de 0; sin embargo si casi todas las células son 4C IE sería aproximadamente 1. Sin embargo, como múltiples rondas de endorreduplicación son comunes en plantas observados IE los valores más altos puede ser mucho mayores. Mientras calcula índices de endorreduplicación puede relativamente sencilla, que requiere que la abundancia relativa de núcleos C valores confiablemente determinar, que está impedido en ciertas especies y tejidos (incluyendo tubérculos de papa). Es probable que las diferencias en el celular la pared celular, la química o la anatomía composición13 causan estas muestras ser recalcitrante para las preparaciones típicas utilizando una cuchilla de afeitar para liberar los núcleos directamente en buffers adecuados que se utilizan con tejidos como el pericarpio de tomate, un modelo de endorreduplicación estudios8.
En Papa, el examen de endorreduplicación dentro el tubérculo sigue siendo limitado a los estudios un par, tal vez debidos en parte a la falta de un protocolo confiable como las mencionadas preparaciones crudas resultados inconsistentes. Si bien estos enfoques funcionan bien para las muestras de tubérculo experimentan severa degradación y una abundancia de ruido en forma de residuos, haciendo diferenciación de picos conformada por núcleos con valores C diferentes casi imposibles de hojas. Esto es quizás debido a diferencias en la composición celular y una profusión de detritos celulares dentro de las células del tubérculo (e.g. amyloplasts almacenamiento de almidón). Para superar este obstáculo, recientemente desarrollamos un protocolo más fiable para la adquisición de picos distinguibles en citometría de flujo de tubérculos de papa. La frecuencia de células dentro de cada pico puede utilizarse para calcular niveles de endorreduplicación precisa para diferentes genotipos o diferentes tejidos que componen un tubérculo. El protocolo, que emplea un antecedente de protoplasto modificado extracción método14,15 descrito previamente flujo cytometry11, mostró una variación considerable dentro de parientes de patatas, variedades y tejidos16 . Aquí presentamos el protocolo en detalle mediante la evaluación de la IE en los contextos de ploidía, tejido y tamaño del tubérculo.
El protocolo aquí presentado ofrece los investigadores un medio para evaluar endorreduplicación en tubérculos de papa, cuyo celular modificado contenido y mayor tamaño de la célula aparentemente excluye otras preparaciones de citometría de flujo. El protocolo se basa en la generación de protoplasto como un medio para reducir el ruido y la suciedad mientras que mantiene integridad nuclear. Previamente, los investigadores han descrito preparaciones similares para las muestras de citometría de flujo especialmente recalcitrante como utilizaron protoplastos de tubérculo para estudiar una variedad de temas como la patogenesia19,20. Sin embargo, a nuestro conocimiento, ningunos han combinado el uso de esos protoplastos de tubérculo con citometría de flujo con el fin de estudiar la endorreduplicación. Por otra parte, encontramos el uso de protoplastos más fiables de preparaciones típicas de crudo, así como la técnica utilizada en los dos solamente otros estudios para evaluar tubérculo endoreduplication6,7. Aquí discutimos las deficiencias del Protocolo, peligros potenciales en su ejecución y muestra la preparación y resultados de un experimento típico que lo emplea.
A pesar de la utilidad y la repetibilidad del Protocolo de citometría de flujo de tubérculo, que tiene algunas debilidades que deben ser discutidas. Para empezar, el protocolo es tiempo intensivo, que requieren dos incubaciones durante la noche. Además, el protocolo requiere algunos reactivos costosos, particularmente la celulasa y macerozyme. Además, las preparaciones son muy sensibles al tiempo, degradantes dentro de unas horas, que pueden limitar el rendimiento en un solo día, especialmente si se desean que los eventos. Por último, el protocolo, mientras que es confiable, es sensible a errores en la preparación de la muestra todos los cuales parecen resultar en daños a los núcleos y resultados de calidad inferiores. Por ejemplo, contaminación microbiana puede ocurrir durante la plasmólisis y protoplasto generación (1 – 3,4) debido a la inadecuada técnica aséptica. Contaminación de las muestras, mientras que no siempre el éxito de una muestra, parece disminuir considerablemente la calidad de los histogramas obtenidos, otra vez probablemente debido al daño a los núcleos.
Como se dijo anteriormente, los principales inconvenientes del protocolo son costos, tiempo y sensibilidad a los errores. Los investigadores deseen tomar medidas para mitigar cada uno de ellos. En cuanto a costo, los investigadores con la intención de aplicar el protocolo para muchas muestras pueden considerar modificar las concentraciones de enzima o duración de la etapa de digestión como diferentes tejidos y genotipos pueden variar en respuesta. Esto incluye la posibilidad de filtrar y reciclar el que previamente se ha demostrado pero no ES empleado aquí21. En cuanto a tiempo, en nuestra observación, es posible prescindir de la primera incubación (paso de plasmólisis) y todavía Extracto de protoplastos; sin embargo, verá afectada su integridad y abundancia, que afecta negativamente los resultados. Para reducir el deterioro de las muestras los investigadores pueden considerar que algunos métodos de citometría de flujo incluyen el uso de fijadores (p. ej., formaldehído) para preservar la integridad de muestra22. Esto puede ser un medio útil tanto evitar su deterioro y permitir muestra almacenamiento en lugar de protoplasto imposición y flujo cytometry que ocurren el mismo día tal como se presenta. Otra forma de prevenir el desgaste de los núcleos puede ser incluir un inhibidor de nucleasas en la CE y/o FBC; mientras que el 2-Mercaptoetanol había efectuada sin cambios durante el desarrollo, otros inhibidores no han sido probados en el presente.
En nuestra observación, el solo paso más crítico es paso 4.4, la extracción de solución de lavado plasmólisis todos antes de la adición del buffer de citometría de flujo (FCB). Si incluso un pequeño volumen (< 10 μl) restos, las muestras son mucho más propensos a ser degradados que pueden conducir a una muestra de pobre o incluso fracasada. Esto es probablemente debido a las impurezas en la solución de la enzima (e.g. nucleasas, proteasas)23,24 que degradan rápidamente los núcleos durante los períodos de incubación y el tiempo entre muestras, incluso a bajas concentraciones. Otra consideración importante es la duración de los pasos de incubación PI y Rnasa. Como se señala en el protocolo, las muestras no permanecen estables durante más de unas pocas horas después de adición de la FCB por lo que los investigadores pueden decidir reducir la duración de estas medidas para acomodar más muestras o citometría de flujo largo procedentes de núcleos baja concentraciones. Esto también requiere que el investigador a considerar el equilibrio entre el número de eventos por muestra y el número total de muestras para ejecutar o considerar el uso de fijadores según lo mencionado previamente.
Diferencias entre los tejidos y los genotipos
Para proporcionar a resultados representante del protocolo hemos diseñado dos experimentos simples para confirmar variación previamente divulgado por el tejido y examinar la influencia de la ploidía y el genotipo. Los resultados del experimento tejido demuestran que el protocolo produce resultados reproducibles, como tejido de médula una vez más fue encontrado para tener el IE más alto. Algo sorprendente tejido de parénquima, que previamente no había sido evaluado, tenía un valor de IE similar al tejido cortical y significativamente menor que la médula. Se trataba de imprevistos como las células del parénquima son típicamente más grandes que ya sea de médula o de células corticales, por lo menos en la madurez. Una posible explicación es que los tubérculos (90 – 130 g) eran demasiado inmaduros para las células del parénquima, que constituyen la mayoría del volumen del tubérculo en la madurez, han ampliado y alcanzó sus máximos valores de C25. Esto también puede explicar por qué el dihaploid (VT_SUP_19) y el dihaploid doblado (VT_SUP_19 4 x) demostró EI significativamente mayor que los tubérculos Superior de CV; mientras que de cada genotipo, se tomaron muestras de tubérculos de aproximadamente igual tamaño, el tamaño máximo de los tubérculos de VT_SUP_19 o tetraploide isogénicas es mucho más pequeño que el de la progenitora. Así, puede ser que muestre mayor IE simplemente porque eran más grandes en relación a su tamaño máximo alcanzable. Por otra parte, la diferencia puede ser una consecuencia del complemento genético que vt_sup_19 recibido de su progenitora tetraploide. Otra posibilidad es que la reducción genómica que ocurrió en la extracción de la dihaploid de la tetraploide puede haber desenmascarado a alelos deletéreos en tensión toda la planta, que también se ha demostrado que contribuyen a la elevada IE26. Sin embargo, esto demuestra que los investigadores de la consideración cuidadosa deben emplear al seleccionar tubérculos y tejidos para ser utilizado para la comparación de los valores de la IE, especialmente entre los genotipos.
Futuras aplicaciones
El protocolo descrito en este artículo ofrece a los investigadores una importante herramienta para comprensión endorreduplicación en Papa. Puede permitir los estudios en los componentes genéticos y ambientales de la endorreduplicación, el curso del tiempo de desarrollo a través de los tejidos del tubérculo y la evaluación de la variación natural. En última instancia, endorreduplicación puede hacer un objetivo prometedor para la mejora de la patata, la empresa que requiere un medio confiable de evaluación.
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada por la nacional Science Foundation Premio número 1237969, “Desenredando el heterocigoto, la composición alélica y variación en número de copias de la papa” y USDA especial beca 2014-34141-22266 (Universidad de Maine) a RV
Serological pipette | Fisher | 13-676-10k | (sterile) |
Pipet Aid XP (autopipettor) | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Conical tubes (50 ml) | Thermo Fisher Scientific | 339652 | (sterile) |
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) | Globe Scientific | 111558 | |
Microcentrifuge tubes (2 ml) | Globe Scientific | 111552 | |
Vacuum filtration unit (0.22µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 564-0020 | (sterile) |
Vacuum filtration unit (0.45µm)(aPES) | Thermo Fisher Scientific | 168-0045 | (sterile) |
Cellulase "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Macerozyme "Onozuka R-10" | Yakult | contact company | |
Hemicellulase | Sigma | H2125 | |
Tris base | Fisher Scientific | BP152-1 | |
MES buffer | Acros Organics | 172590250 | |
Triton X-100 | MP Biochemicals | 194854 | |
Magnesium Chloride (hexahydrate) | Fisher Scientific | M35-500 | |
Calcium Chloride (dihydrate) | Fisher Scientific | C79-500 | |
D-Mannitol | Acros Organics | 423922500 | |
MOPS | Acros Organics | 17263-0250 | |
Potassium Phosphate (monobasic, anhydrous) | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
Propidium iodide | Sigma-Aldrich | P4170 | For flow cytometry preparations |
Ribonuclease A | Sigma-Aldrich | R5000 | For flow cytometry preparations |
Cork borers with punch | American Scientific | 2093-02 | For smapling desired tissue |
Forceps | Thermo Fisher Scientific | 16-31 | For smapling desired tissue |
Scalpel | Thermo Fisher Scientific | 08-920B | For smapling desired tissue |
106um stainless steel mesh or other seive of same pore size | New Jersey Wire Mesh Co. | contact company |