Summary
Burada, izole ve fare peritoneal mast hücreleri yetiştirmek için bir protokol mevcut. Biz de onların fonksiyonel karakterizasyonu için iki protokol tarif: hücre içi ücretsiz Ca2 + toplama ve degranulation tahlil floresan bir görüntüleme dayalı yayımlanan β-hexosaminidase Renkölçer miktar üzerinde.
Abstract
Mast hücreleri (MCs), bağışıklık sisteminin bir parçası olarak ana bilgisayar çeşitli patojenlere karşı savunmak ve alerjik bağışıklık yanıtı başlatılması önemli bir rol oynar. MCs aktivasyonu IgE bağlı yüksek afinite IgE reseptör (FcεRI) yanı sıra çeşitli diğer reseptörleri uyarılması yoluyla yüzey cross-linking üzerinden ücretsiz intrasellüler Ca2 + düzeyi yükselişi başlatır ([Ca2 +]ben) Bu inflamatuar ve alerjik arabulucu yayın teşvik etmektedir. Moleküler bileşenlerin bu sinyal yollar dahil tanımlaması MC işlevi Yönetmeliği anlamak için önemlidir. Bu makalede, biz fare bag doku türü MCs peritoneal lavaj tarafından yalıtım ve periton MCs (PMCs) tarımı için bir iletişim kuralı tanımlamak. MCs kültürleri Bu metodoloji tarafından çeşitli nakavt fare modellerinden proteinler yolları sinyal MC dahil tanımlaması için faydalı bir yaklaşım temsil eder. Buna ek olarak, ayrıca MCs. floresans tabanlı izleme [Ca2 +]ben içinde sinyal Ca2 + miktar için önemli bir teknik bir güvenilir olduğu gibi tek hücre Fura-2 görüntüleme için bir protokol açıklar ve sık kullanılan yaklaşım olaylar, MC harekete geçirmek için son derece önem taşıyor kalsiyum deposu ile çalışan giriş de dahil olmak üzere sinyal Ca2 + çalışma. MC degranulation analiz için β-hexosaminidase yayın tahlil açıklar. Degranulation kalem MCs. β-hexosaminidase içinde açıklanan tüm üç farklı salgı alt kümeleri için kolayca onun reaksiyonu ile bir colorigenic substrat tarafından sayısal olarak β-hexosaminidase kültür orta serbest miktarı kabul edilir bir microtiter plaka Renkölçer tahlil. Bu son derece tekrarlanabilir teknik düşük maliyetli ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Genel olarak, yüksek bir verim sağlanan iletişim kuralı gösterir tipik MC yüzey işaretleyicileri ifade MCs MCs tipik morfolojik ve fenotipik özellikleri görüntülemek ve secretagogues Ca2 +- son derece tekrarlanabilir yanıt gösteren görüntüleme ve degranulation deneyleri.
Introduction
MCs doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık yanıtı sırasında önemli bir rol oynamaktadır. Özellikle, MCs patojenler, bakteri ve parazit gibi öldürülmesi katılmak ve aynı zamanda potansiyel olarak toksik endojen peptidler veya zehirlerini (için gözden geçirme bakın Galli ve ark. 20081) bileşenlerinin bozulmasına yol açar. Doğuştan gelen ve edinilmiş bağışıklık MCs fizyolojik rolü ısıtmalı tartışma konusudur. Bu nedenle, çok sayıda veri tutarsızlıkları farklı MC-eksik fare modelleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda Anti2ötesinde immünolojik fonksiyonların MCs sistematik bir yeniden değerlendirme gerektirir. Olgun MCs çoğunlukla doku ve organları deri, akciğer ve bağırsak gibi içinde lokalizedir ve genellikle küçük rakamlarla sadece kan bulunur. MCs hematopoetik öncüleri, MC ataları gibi türetilir ve onların farklılaşma ve hemen hemen tüm bozukluklarına dokular1microenvironments içinde olgunlaşma tamamlayın. T-hücre kaynaklı faktör interlökin (IL) -3--dan onların hematopoetik ataları3seçmeli olarak canlılığı, yayılmasını önleme ve fare MCs pluripotent nüfusu farklılaşma teşvik etmektedir. Kök hücre faktörü (SCF) dokularda yapısal hücreleri tarafından üretilen ve MC geliştirme, hayatta kalma, göç ve işlev4önemli bir rol oynar. Bireysel MCs özelliklerini sentez ve çeşitli proteaz veya proteoglikanlar depolamak için yeteneklerini bağlı olarak farklı olabilir. Farelerde, sözde Bag Doku tipi MCs anatomik lokalizasyon, Morfoloji ve heparin ve proteaz5içeriğine göre mukozal MCs dan ayırt edilirler.
MCs, artış ücretsiz sitozolik Ca2 + ([Ca2 +]ben) degranulation ve üretim eikozanoidler, yanı sıra sitokinler sentezi ve transkripsiyon faktörleri yanıt antijen olarak aktivasyonu için vazgeçilmez ve çeşitli secretagogues6. Bir büyük aşağı akım bu uyaranlara phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate diacylglycerol (DAG) ve inositol 1,4,5-trisphosphate hidrolize Fosfolifaz C, hedeftir. Protein kinaz C DAG etkinleştirir ve IP3 Ca2 + endoplazmik retikulum üzerinden iyonları serbest bırakır. Bu mağazaların tükenmesi Ca2 + akını işletilen kalsiyum giriş (SOCE) depolamak için önde gelen plazma zarı Ca2 + kanal, üzerinden etkinleştirir. Bu işlem, Ca2 +etkileşim yoluyla uyarılmış-sensör, stromal etkileşim molekülü-1 (Stim1), Orai17 ile yanı sıra geçici reseptör potansiyel kurallı (TRPC) Kanal aktivasyonu aracılığıyla endoplazmik retikulum ' proteinler (için gözden geçirme bkz: Freichel vd. 20148) plazma zarı içinde.
İncelemek için bu kanal, çeşitli farmakolojik fizyolojik rolü (kanal blokerleri uygulanması) veya genetik yaklaşımlar genellikle kullanılır. İkinci durumda, protein ifade bastırılması mRNA (devirme) hedef alarak elde edilir veya genomik DNA düzenleme bir kanal (nakavt) alt birimi oluşturan bir gözenek kodlama bir exon global ya da doku-özel9 silme işlemine. Availability-in a kütük parçası bu kanallar için yeterli özgüllük ile sınırlıdır. Buna ek olarak, devirme yaklaşım dikkatli kullanarak, Örneğinkendi etkinliğini kontrolünü gerektirir., Batı analiz leke ve birçok durumda hedeflenen kanal protein için özel antikorlar kullanılamamasıdır tarafından engel oluyor. Böylece, nakavt fare modelleri kullanımını hala böyle analiz için altın standart olarak kabul edilir. Bir tercih edilen vitro MC fonksiyonlar soruşturma için tam olgun bir nüfus olarak izole ex vivo olabilir PMCs ekimi modeldir ( e.g--dan, MCs vitro ayırt karşı., kemik iliği hücreleri)10 . MC işlevi vitro, FcεRI ve beta-hexosaminidase uyarılması çalışmaya da sık kullanılan kemik iliği türetilmiş MCs ile karşılaştırıldığında (BMMCs), serbest 8-fold ve 100-fold PMCs, sırasıyla arttırılır. Bu makalede, saf bağ dokusu yüksek sayıda kültür 2 hafta MCs, daha fazla çözümleme için yeterli yazdıktan sonra elde etmek için izin veren fare PMCs, tarımı ve yalıtım yöntemi açıklanmaktadır.
Geliştirme ve uygulama genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerin son ilerlemeye rağmen bunların kullanım hala hedef hücrelere gen teslim zorluklar tarafından özellikle, son derece uzmanlaşmış hücreleri gibi birincil kültürlü MCs sınırlıdır. Buna ek olarak, bu grup için [Ca2 +] ölçümleriben floresan göstergelerin hala ratiometric boyalar ile yüksek dinamik Aralık yoksun. Bu nedenlerden dolayıben ratiometric [Ca2 +] ölçüm için tercih edilen yöntem hala floresan boya "Fura-2"11kullanmaktır.
Şu anda, en sık yaklaşım MC harekete geçirmek değerlendirilmesi için kullanılan. ve degranulation β-hexosaminidase aktivitesinin ölçümdür. Β-hexosaminidase, Alerjik bir arabulucu sabit oranda MCs12histamin ile birlikte yayımlanan MC granül bileşenlerden biridir. Β-hexosaminidase Mikroplaka Renkölçer assay olarak kolayca algılanabilir bir colorigenic ürün ölçülebilir bir miktar üretir belirli bir yüzey ile onun reaksiyonu ile kolayca ve doğru bir şekilde ölçülebilir. Bu makalede, bir uygulama PMCs degranulation çeşitli uyaranlara yanıt olarak çözümlenmesi için bu tekniğin bildirilmektedir.
Toplama yüksek benzeşme plasmalemmal IgE reseptör (FcɛRI) bir yayın salgı granül içerik çevreleyen ekstrasellüler alanda önde gelen bir çok yönlü hücre içi sinyal yolu, MCs içinde etkinleştirir. Spesifik antijen ek olarak, birçok diğer bir çekim gücü-ebilmek harekete geçirmek immunomodulatory arabulucu, tamamlayıcı anaphylatoxins gibi çeşitli bir dizi serbest bırakmak için MCs (Örn., C3a ve C5a)13, vasoconstrictor peptid endotelin 1 (ET1)14 , o kadar çok sayıda katyonik maddeler ve pseudoallergic reaksiyonlar provoke uyuşturucu olarak (Örn., icatibant)15 MRGPRX216bağlama yaparak. Hücre içi sinyal yolları MRGPR kaynaklı MCs degranulation ilgili kötü FcɛRI-aracılı hücre içi sinyal ile karşılaştırıldığında karakterizedir; Bu yollar sadece son birkaç yıl17 sırasında reseptör kimlik16sonra yoğun bir şekilde incelenecektir başladı. Büyük ölçüde, plazma zarı iyon kanalları MRGPRX2 stimülasyon tarafından takip kalsiyum giriş dahil anlaşılması kalır. Bu nedenle, mevcut makale da hücre içi kalsiyum sinyal üzerinde duruluyor ve MCs degranulation MRGPR agonistleri ile uyarılmış.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan yordamları için bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanlarının (Karlsruhe bölgesel Konseyi tarafından resmen onaylanmış) Alman mevzuat esaslarına göre yapıldı.
1. PMC yalıtım ve yetiştirme mayi lavaj tarafından
| 1 | Buz |
| 2 | 10 mL şırınga |
| 3 | 27 G iğneler |
| 4 | 20 G iğneler |
| 5 | Strafor blok ve toplu iğneler |
| 6 | Koleksiyon tüpler (50 mL plastik santrifüj tüpleri) |
| 7 | % 70 etanol |
| 8 | RPMI Orta (soğutulmuş ve buz üzerinde tutulması öncesi) |
| 9 | PMC Orta: RPMI orta + % 20 FCS (Fetal buzağı Serum) + %1 penisilin streptomisin çözüm (kalem-Strep) |
| 10 | Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz - DPBS (olmadan Ca2 + ve Mg2 +) |
| 11 | Kültür şişeler (25 cm) |
| 12 | Büyüme faktörleri stok çözümleri (IL-3: 1 μg/μL; SCF: 2.5 μg/mL) |
| 13 | Serolojik pipetler (10 mL) |
| 14 | Pipetler ipuçları steril (20-200 µL) |
| 15 | Hemasitometre |
| 16 | Tezgah santrifüj |
| 17 | Makas ve forseps |
| 18 | CO2 odası fareler için |
| 19 | Açık steril hood |
| 20 | Kapalı steril hood |
| 21 | Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) |
| 22 | Transfer pipetler (20-200 µL) |
Tablo 1: Adım 1 için malzemeler.
-
PMC yalıtım mayi lavaj tarafından
- Önce hücre izolasyon, Tablo 1' de listelenen malzemeleri hazırlayın.
- 8 14 haftalık erkek farelere PMC yalıtım için kullanın. Bir fare CO2 inhalasyon tarafından ötenazi ve refleks kaybı tarafından ölüm onaylayın. Fare % 70 etanol ile sprey ve iğne (dorsal tarafta aşağı) kullanarak bir köpük blokta düzeltebilirim. Künt kenar makas kullanırken fare ventral cilt kaldırın. Periton boşluğuna zarar vermemek.
Not: Biz genellikle bu iletişim kuralı bir C57BL/6N suşu genetik geçmişi olan fareler için kullanın. - 7 mL buz gibi RPMI orta ve hava 27 G iğne ile donatılmış bir 10 mL şırınga kullanarak Periton boşluğunda 5 ml enjekte. İğne dikkatle periton itin ve herhangi bir organ sorgulamaktı değil. Bir nokta epididimal yağ bölgede bir organ perforasyonu riskini azaltmak için kullanın.
- Enjeksiyon sonra fareyi periton hücreleri RPMI orta ayırmak 1 dk için salla. Fare çok güçlü, iç organlara zarar verme ve periton boşluğuna kan ile bulaşıcı önlemek için sallama.
- 10 mL şırınga ile yeni bir 20 G kanül teçhiz tarafından yeniden. İç organları köpük blok devirme ve yavaşça bankta orta aspirasyon diğer taraftan kolaylaştırmak için dokunarak bir tarafa kaydır. 20 G iğne ekleme kadar yükseltin, eğin ve nazikçe ve yavaşça karın sıvı Aspire edin (~0.5 mL/iç organları tarafından tıkanmasını önlemek için s). Kadar sıvı (genellikle 5-6 mL) mümkün olduğunca toplamak.
- Ve bir toplama tüp toplanan hücre süspansiyon buza transfer iğne şırıngadan çıkarın. Görünür kan kirlenme ise bir örnek tüp atmak.
- ~ 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon ile tüpler santrifüj kapasitesi. Steril bir başlık altında süpernatant Aspire edin. Her fare için soğuk (4-10 ° C) 4 ml örnek parçaları birleştirmek PMC orta ve 25 cm2 kültür şişesi hücre süspansiyon aktarmak. Büyüme faktörleri IL-3 ve SCF son konsantrasyonları 10 ng/ml ve 30 ng/mL, sırasıyla ekleyin. Bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO2) hücreleri içeren şişeye koyun ve ~ 48 h için sonraki yordama kadar kuluçkaya.
-
PMC kültür
- 2. gün (~ 48 h yalıtım sonra): orta değiştirmek
- Kaldırmak için (eritrositler ve ölü hücreleri), süpernatant ve yapışık olmayan hücreleri Aspire şişeye ortamından Pasteur pipet ucu şişeye kenarında yerleştirerek ve şişeye neredeyse yatay tutarak. Önceden ısıtılmış PMC orta fare başına 4 mL ekleyin. Büyüme faktörleri IL-3 Ekle (10 ng/mL) ve SCF (30 ng/mL). Bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO2) hücreleri içeren şişeye koyun.
- 9. gün: hücre bölme
- Hücre süspansiyon hücre kültür balonun 50 mL plastik santrifüj tüpüne aktarın. Üç kez 10 önceden ısınmış mL (37 ° C) Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz çözeltisi (DPBS) ile şişeye yıka, plastik santrifüj kapasitesi ile aynı 50 mL müstakil hücrelerde hücre süspansiyon toplama tüp. Bir hemasitometre tarafından hücre konsantrasyonu saymak ve hücrelerin toplam sayısını hesaplamak.
- ~ 300 x g 5 min için de hücre süspansiyon santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin. Önceden ısıtılmış PMC hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre/mL elde etmek için orta (37 ° C) Pelet kurtarmak. Hücre süspansiyon için yeni bir 25 cm2 kültür şişesi aktarın. Altına kalarak fibroblastlar ile eski şişesi atmak.
- Büyüme faktörleri IL-3 Ekle (10 ng/mL) ve SCF (30 ng/mL) ve bir kuluçka (37 ° C ve % 5 CO2) hücreleri içeren şişeye koyun.
- Gün 12-15: hücre ölçümleri
- Eğer herhangi bir deney FcɛRI reseptörlerinin uyarımı ile planlanmış, IgE anti-DNP standart kültür ortamında 300 ng/mL gecede hücrelerle pretreat. Adım 2 adım 3 ile devam.
- 2. gün (~ 48 h yalıtım sonra): orta değiştirmek
2. Fluorometrik hücre içi ücretsiz kalsiyum konsantrasyonu ölçümü PMCs
- Ölçümleri önce Tablo 2' de listelenen malzemeleri hazırlayın. Ayrıca, bir görüntüleme oluşan Kur hazırlayın: floresan mikroskop ters; Amaç: 40 X / 1.3 petrol; Fura 2 filtre ayarlamak; CCD kamera; Uyarma ışık kaynağı; Görüntüleme satın alma programı; Yerçekimi beslenen çözüm uygulama sistemi.
| 1 | PMC (12-15 gün eski) 1 x 106 hücre/mL |
| 2 | Concanavalin A |
| 3 | Fura-2 AM |
| 4 | Pluronic F-127% 20 çözüm |
| 5 | Kapak paket fişi gözlük turu; ø 25 mm; No 1 |
| 6 | DNP-HSA (dinitrophenol-insan serum albümin) hisse senedi çözüm |
| 7 | Anti-DNP-antikor (IgE) hisse senedi çözüm |
| 8 | Düz alt plaka (12 kuyu) |
| 9 | Bileşik 48/80 hisse senedi çözüm |
| 10 | De Chambers Imaging kapak |
| 11 | Hemasitometre |
| 12 | Transfer pipetler (20-200 µL) |
Tablo 2: Malzemeler için adım 2.
-
Fura-2 görüntüleme hazırlık
- Gerçekleştirmek bir hemasitometre kullanan bir hücre sayısı ve hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre/ml ayarlayın. PMCs kolonileri yavaşça (3-5 defa) 1 mL pipet ucu ile hücre süspansiyon pipetting tarafından bölünmüş.
- Bir Ca2 +hazırlamak-HEPES içeren tamponlu tuz solüsyonu (Ca2 +- HBSS) 135 mM NaCl, 6 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM MgCl2, 10 mM HEPES ve 12 mM glikoz oluşur. PH 7.4 ile 3 M NaOH için ayarlayın.
- Concanavalin A hazırlamak her 25 mm kaplamalı slaytlarda concanavalin A çözüm (0.1 mg/mL H2O) pipetting 1 damla tarafından yuvarlak cam steril bir başlık altında. En az 1 dk. için kapak fişleri üzerinde damla bırakın, ardından bir pipet ve kapak paket fişi kuruması için 45 dk. dikkatle basın odası Imaging kauçuk concanavalin tedavi A kapak paket fişi izin çözümle çoğunu kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek) kadar Chambers'ı görüntüleme mikroskobu elde etmek için ekleyin.
Not: Poly-L-lizin kaplı slaytlar alternatif olarak kullanılabilir. - Floresan Ca2 + boya Fura-2 dağıtılması AM (1 mM) dimetil sülfoksit (DMSO) içinde. Işıktan korunan bu çözüm saklayın.
- Fura-2 seyreltik AM hisse senedi çözümde Ca2 +HBSS-"yükleme tampon" hazırlamak için 5 mikron son bir konsantrasyon için. 5 µL/mL % 20 pluronic F-127 DMSO ile ek.
- "Yükleme"ile tampon 500 µL PMC hücre süspansiyon Mix 500 µL. Karışım görüntüleme odasına pipette ve hücreler için 20-30 dk içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Uygulama sistemi stimülasyon protokolüne göre farklı çözümler ile beslenen yerçekimi ayarlayın. Şırınga 1 40 mL Ca2 +- HBSS çözeltisi ile tamamlamak, 40 mL 100 ng/mL DNP içeren Ca2 +- HBSS çözeltisi ile 2 şırınga, 40 mL 50 µg/mL bileşik 48/80 içeren Ca2 +- HBSS çözeltisi ile 3 şırınga, 4 ile 40 mL şırınga sözde Ca2 +-ücretsiz-HBSS çözüm ve 5 ile sözde Ca2 +40 mL şırınga-ücretsiz-2 µM içeren HBSS çözüm Thapsigargin.
- 40 X yüksek diyafram yağı daldırma amaç üzerinde Daldırma yağ küçük bir damla koyarak hazırlamak.
- Uygulama sistemi ters mikroskop sahnede monte. Uygulama sistemde yüklü hücrelerle görüntüleme odası koymak ve hareket kayıt sırasında önlemek için güvenli. İletilen ışığı ve hücreleri odaklan.
- Hücreleri üç kez yerçekimi beslenen uygulama sistemi kullanılarak Ca2 +- HBSS arabellek ile yıkayın.
- Ca2 +hücrelerde kuluçkaya - HBSS Fura-2 için 5 min için PM de-esterleşme.
- Hücreleri görüntüleme başlamadan önce bir kez daha durulama, herhangi bir potansiyel olarak kaldırmak için floresan boya sızdırılmış.
-
Hücre görüntüleme
- Görüntüleme satın alma programı fizyolojik satın alma modunda başlatın. Kurulum penceresini açmak ve odak ve en iyi satın alma saati ayarlama (hangi-meli var olmak için uyarma 340 ile aynı nm ve 380 nm ve genellikle aralıkları arasında 50-150 ms).
Not: Fura-2 pozlandırmayı en aza indirmek için boya photobleaching önlemek için herhangi bir ışık dolu hücre. - Bir referans resim ve hücreleri faiz (ROI) bölgeleri olarak işaretleyin. Bir alanda nerede hiçbir hücre varsa ve arka plan olarak tanımlamak son ROI işaretleyin.
- Kurulumu tamamlamak ve ölçüm 5 s Alım hızı ile başlar.
Not: Hücreleri dönüşümlü olarak uyarma, 340 ile hafif vurgulanır nm ve 380 nm ve verilmiş Floresan (> 510 nm) CCD kamera ile toplanacaktır. Floresan sinyallerini F340 nm ve F380 nm gibi (F340 nm/F380 nm) oranı görüntüleri-ecek var olmak göstermek içinde üç pencere eşiği. Bireysel ROIs floresan yoğunluğu zaman ders çizelgeleri değerleri aynı zamanda sürekli olarak gösterilecek demek. - Çözümler deneme tasarımına göre uygun döngüsü numaradan ekleyin:
- Antijen kaynaklı ölçü yükselmesine [Ca2 +]ben, için döngüsü 20 ve döngüsü sonra 150 kaydı durdurmak sonra şırınga 2 çözüm Şekil 2A, 2Bgösterildiği gibi geçerli.
- Bileşik 48/80 kaynaklı ayrıcalık yükselmesi [Ca2 +] ölçmek içini, Şekil 2C, resimli olarak geçerli şırınga 3 çözüm döngüsü 20 ve döngüsü sonra 150 kayıt dur sonra.
- Şekil 2' deDgösterildiği gibi SOCE tarafından uyarılmış [Ca2 +]ben yüksekliğini ölçmek için şırınga 4 çözüm döngüsü 10 sonra uygulamak, şırınga 5 çözüm döngüsü 70 sonra uygulamak, şırınga 4 çözüm döngüsü 120 sonra uygulamak, şırınga 1 çözüm döngüsü sonra 150 uygulamak ve döngüsü 220 sonra kaydı durdurmak.
- Ölçüm bitirdikten sonra sonuçları hem uyarma dalga boyu ile ve arka plan düzeltme olmadan yanı sıra ile ve her yatırım getirisi için arka plan düzeltme olmadan oranı değerleri için ölçülen yoğunluklarını içeren bir oranı tabloya dönüştürmek ve her ölçüm süresi noktası. Satın alma programı arka arkaya basın düğmeleri: "Başlat kesici", "tüm mark", "tüm dönüştürmek", "Fizyoloji ölçümleri", "Tamam,"Tamam". Tablolar ve çevrimdışı analiz için görüntü yığınları olarak dosyaları kaydedin.
- Görüntüleme satın alma programı fizyolojik satın alma modunda başlatın. Kurulum penceresini açmak ve odak ve en iyi satın alma saati ayarlama (hangi-meli var olmak için uyarma 340 ile aynı nm ve 380 nm ve genellikle aralıkları arasında 50-150 ms).
3. beta-hexosaminidase yayın ölçüm PMCs
| 1 | PMC (12-15 gün eski) 1 x 106 hücre/mL |
| 2 | Anti-DNP-antikor (IgE) hisse senedi çözüm |
| 3 | DNP HSA hisse senedi çözüm |
| 4 | Bileşik 48/80 hisse senedi çözüm |
| 5 | Ionomycin |
| 6 | 96-şey plaka, v şeklinde alt |
| 7 | 96-şey kaplamalar, düz dipli |
| 8 | Plastik santrifüj tüpleri (15 mL) |
| 9 | Serolojik pipetler |
| 10 | Hücre inkübatör (37 ° C ve % 5 CO2) |
| 11 | Tezgah santrifüj |
| 12 | Microtiter plaka okuyucu için optik yoğunluk ölçümleri |
| 13 | Çok kanallı pipet (20-200 μL) |
| 14 | Hemasitometre |
Tablo 3: Malzeme için adım 3.
- Önce ölçümleri, Tablo 3' te listelenen malzemeleri hazırlayın.
Not: β-hexosaminidase MCs kendi stimülasyon sonra yayımlanan p-nitrophenyl-asetil-D-glucosamine (pNAG) p-nitrophenol ve N-asetil-D-glucosamine hidrolize. β-hexosaminidase örnek miktarı oluşturulacak p-nitrophenol miktarı ile orantılıdır. Çözümün"durdurmak" yüksek pH ortamında, p-nitrophenol tam olarak deprotonated p-nitrophenolat bulunmaktadır ve 405 ışık onun absorbans tarafından algılanan nm. - 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1.4 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 5.6 mM glikoz ve BSA %0,1 içeren Tyrode'nın çözüm hazırlamak. PH 7.4 ile 3 M NaOH için ayarlayın.
- Lizis çözüm Tyrode'nın çözüm Triton X-100% 1 hacmi ekleyerek hazırlayın.
- 200 mM glisin oluşan durmak eriyik hazırlamak ve pH NaOH ile 10,7 için ayarlayın.
- PNAG çözüm (4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside) çözüm pNAG 0.4 M sitrik asit son konsantrasyonu 4 mm çözülerek hazırlayın.
- Tahlil için gerekli hücre miktarını hesaplamak (tahlil yinelenen içinde gerçekleştirin). 200.000 PMCs iyi kullanın. 2 kuyu negatif denetimleri (Tyrode'nın çözüm DNP gibi herhangi bir secretagogues veya bileşik 48/80 olmadan) kullanın ve olumlu denetimleri olarak 2 wells (Tyrode'nın çözüm 10 µM ile Ionomycin) her genotip için.
- Hücreleri 15 mL plastik santrifüj tüpüne transfer Tyrode'nın çözüm ile 15 ml ses seviyesini ve 4 dk. süpernatant Pasteur pipet ile kaldırın ve Tyrode'nın çözüm 2 x 106 hücrelere hücrelerde resuspend için de 200 x g santrifüj kapasitesi /mL.
- Hücre süspansiyon iyi başına 100 µL bir 96-şey V-alt iyi plaka aktarın. Her şey ( Şekil 3' teAresimli pipetting düzeni göre) 25 µL stimülasyon veya kontrol çözümü ekleyin. 45 dk 37 ° C ve % 5 CO2için hücreleri kuluçkaya.
- Reaksiyon on Ice 5 min için 96-şey plaka koyarak durdurmak. Sonra 120 x gde 4 dk 4 ° C'de plaka santrifüj kapasitesi. Bir düz-alt 96-şey plaka için çok kanallı pipet kullanarak süpernatant ile 120 µL aktarmak ve buza koyun. Dikkatli bir şekilde hücre topakları dokunmaktan kaçının, ama tamamen süpernatant Aspire edin.
- 125 µL lizis arabelleği hücre topakları ekleyin. Oda sıcaklığında 5 min için hücre topakları kuluçkaya ve onları kuluçka sonra tekrarlanan (yaklaşık 5 kat) pipetting tarafından resuspend.
- Yeni bir düz-alt 96-şey plaka gerekli Wells pNAG çözüm (4 mM) 25 µL pipet. 25 µL her süpernatant her hücrenin lysate 25 µL yanı sıra hazır pNAG çözüm ekleyin.
- Reaksiyon toplu işlemleri 37 ° C'de 1 h için kuluçkaya Kuluçka sonra durmak eriyik için tepki durdurmak için her şey 150 µL pipet.
- 405 bir çift dalga boyu ayarı kullanarak Mikroplaka Okuyucu ile plaka analiz nm ile başvuru 630 nm için otomatik arka plan çıkarma. Satın alma programı, tıkırtı belgili tanımlık kutu "Başvuru" ve "Absorbans" program öğesi menüsünü seçin "630 nm" aþaðý açýlan listesinden. Örnekleri optik yoğunluğu çok yüksek ise, remeasuring önce uygun bir seyreltme inceleyebilirsek hazırlayın.
- β-hexosaminidase açıklamasına göre aşağıdaki denklemi yüzdesini hesaplamak:
Yayın [%] özel beta-hexosaminidase yayın yüzde, bir [süpernatant] arka nerede süpernatant emilimini düzeltilmiş ve arka planın bir [lysate] olduğu karşılık gelen hücre lysate emilimini düzeltildi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PMCs 3 yaban tipi fareler (C57BL/6N) tarafından mayi lavaj izole edildi ve takıma RPMI ortamda daha fazla kültürlü % 1 ile % 20 FCS kalem-Strep büyüme faktörleri (IL-3 10 ng/mL) ve SCF 30 ng/mL steril altında huzurunda koşulları nemlendirilmelidir 37 ° C ve % 5 CO2. Orta gün 2 ve 9 hücre izolasyon sonra değiştirildi. Hücre morfolojisi iletimi kullanılarak analiz edildi ışık DIC görüntüleme (bkz. Şekil 1A, B). Hücre kontrast ve parçalı yapı iyi hücre canlılığı gösterilmiştir. Bu koşullar altında kültür 2 hafta sonra 1.5 x 107 hücreleri homojen bir nüfusa elde edildi. Akış Sitometresi Analizi FITC ile Birleşik anti-IgE antikor ile birlikte lekeli hücreleri ve Anti-c-Kit antikor PE ile Birleşik %98.6 FITC pozitif ve % 99.8 PE pozitif hücre (Şekil 1C) saptandı. 98,5 kültürlü hücreleri % FITC ve PE (Şekil 1C), için olgun MCs tipik özelliklerini gösteren Çift Kişilik olumlu idi.
Daha fazla fonksiyonel analiz için elde edilen hücre Fura-2 floresan gösterge kullanarak Fluorometrik [Ca2 +]ben ölçümleri yapıldı. Fura-2 dolu hücreleri dönüşümlü olarak ışıklı ile 340 nm ve 380 nm uyarma ışık her 5 s ve floresan > 510 nm kayıtlı bir CCD kamera ile. Floresan (F340/F380) oranını sürekli takip. DNP uygulanması (100 ng/mL) gecede 300 ng/mL ile IgE inkübe PMC için anti-DNP belirgin bir ayrıcalık yükselmesi yavaş yavaş birkaç dakika (Şekil 2A, B) yarım maksimum çürük [Ca2 +]ben seviye, uyarılmış. Hücre yanıt değişkenliği nispeten düşük (Şekil 2A, B). MRGPRB2 reseptörlerinin uyarımı ile 50 µg/mL, bileşik 48/80 aynı saati iletişim kuralı ile [Ca2 +]i PMCs (Şekil 2C) yanıtının çok benzer bir ortalama genlik ile Fura 2 yüklü içinde de önemli ölçüde arttı. PMCs SOCE analiz için bir "yeniden ekleme" Protokolü uygulandı: 10 döngüsünden sonra ölçüm başlangıcı dış Ca2 + kaldırıldı ve sırasında 70-120, Thapsigargin devir (2 µM), endoplazmik retikulum ATPaz, bir inhibitörü yapıldı. intrasellüler Ca2 + Stok tükenmesi ve maksimal SOCE aktivasyonu için uygulanan. Geçici [Ca2 +]ben yükseltilmesine intrasellüler Ca2 + mağazalarda Ca2 + yayınlamasını yansıyan bir sözde Ca2 +-ücretsiz banyo çözeltisi (Şekil 2D). [Ca2 +]i düzeyi (Şekil 2D) SOCE kanallar aracılığıyla Ca2 + akını nedeniyle önemli bir artış döngüsü 150 sonuçlandı sonra dış Ca2 + konsantrasyonu 2 mM için geri yükleme. Bu bileşeni Ca2 + yanıtının güçlü 10 µM GSK 7975A, huzurunda inhibe değişmeden (Şekil 2D Ca2 + yayın intrasellüler Ca2 + mağazalardan kaldı ise bir CRAC engelleyici bilinen ).
Sonraki adımda, izole PMCs yeteneği degranulation FcɛRI yüksek afinite reseptörleri polietilenin veya MRGPRB2 reseptörleri uyarılması üzerine geçmesi için test ettik. Bu amaçla, β-hexosaminidase yayın tahlil gerçekleştirildi. Hücreleri bir V-alt 96-şey plaka (2 x 105 hücreleri/de) eklendi ve Şekil 3A 37 ° C'de 45 dk için resimli düzenine göre teşvik Plaka centrifuged ve süpernatant ile kaldırıldıktan sonra granül lysed. Β-hexosaminidase içeriği Pelet lysates ve bireysel supernatants pNAG ile tepkilerini tarafından 37 ° C'de 1 h kuluçka sırasında analiz edildi Reaksiyon ürünlerin miktarı colorimetrically algılandı ve (bkz. Şekil 3B) yayımlanan β-hexosaminidase yüzdesi hesaplanmıştır. Spontan yayın (% 1), çok düşük iken yanıtları 10 µM gibi güçlü degranulation uyaranlara Ionomycin bileşik 48/80 50 µg/mL den fazla % 40 ve % 60, idi. Degranulation yanıt DNP uyarılması için doz bağımlı olarak 10 – 300 ng/mL konsantrasyon aralığı boyunca. Birlikte, bu veriler açıkça izole PMCs iyi bir fonksiyonel durumunu belirtir.
Resim 1 : İlköğretim karakterizasyonu kültürlü DIC mikroskobu ve Akış Sitometresi Analizi kullanılarak gerçekleştirilen fare vahşi türü PMCs. (A, B) Temsilcisi görüntüleri elde edilen mayi lavaj(a)ve günde 9 kodlamayla (B) hücre izolasyon sonra 25 cm2 plastik şişeler 1s içinde kültürlü PMCs 20 X plasDIC amacı istimal. Ölçek çubukları sağ alt köşede belirtmek floresein Isothiocyanate (FITC) ve Anti-c-kit ile Birleşik anti-IgE antikor ile birlikte lekeli 100 µm. (C) Akış Sitometresi Analizi PMCs (yukarıda açıklanan protokolüne göre kültürlü 12 gün) antikor Phycoerythrin (PE) ile Birleşik. Hücre yoğunluğu Arsa dört çeyrek daire ikiye bölünmüş durumda: Q1, PE yukarıda autofluorescence düzeyi/FITC autofluorescence seviyenin; S2, PE autofluorescence düzeyi/FITC autofluorescence seviyesinden yukarıda; Q3, PE autofluorescence düzeyi/FITC autofluorescence seviyesinin altında aşağıda; Q4, PE autofluorescence düzeyi/FITC autofluorescence seviyesinden aşağıda. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Kayıt [Ca2 +[] ben Fura-2'vahşi türü fareler izole PMCs yüklü. [Ca 2 + []ben floresan F340/F380 oranı sundu. (A)[Ca2 +]ben zaman seyri bireysel PMCs temsilcisi izleri (n = 38) DNP ile uyarılmış (100 ng/mL). (B) DNP saat ders (100 ng/mL)-[Ca2 +] yükseltmeben uyarılmış. Her veri noktası A. panelinde resimli 38 bireysel hücrelerden elde edilen ortalama değerler gösterir PMCs gecede 300 ng/mL ile IgE anti-DNP ön işleme. (C) bileşik 48/80 kaynaklı ortalama değerlerinin zaman ders [Ca2 +]ben yükseklik PMCs (n = 60). (D) saat ders [Ca2 +]ben değişiklikleri sırasında intrasellüler Ca2 +ortalama değerlerden-2 µM uygulama tarafından indüklenen tükenmesi saklamak sözde Ca2 +Thapsigargin (Tg)-ücretsiz çözüm, mağaza tarafından takip 2 mm Ca2 + banyo çözüm kontrol grubunda yeniden ekleme sonra kalsiyum akını işletilen (n 44 =) PMCs (siyah kareler) ve GSK 7975A 10 µM (mavi kareler) banyo çözümde varlığında (n = 41). B, C ve D hata çubukları ortalama standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Beta-hexosaminidase vahşi türü fareler izole PMCs ile gerçekleştirilen Renkölçer çok iyi ölçümleri serbest. (A)stimülasyon düzeni beta-hexosaminidase tahlil; gerçekleştirmek için 96-şey plaka pipetting, Sonuçlar panelinde B. "Spontan" Tyrode'nın çözüm ek herhangi bir secretagogues olmadan pipetting için karşılık gelen sunulur; IM Ionomycin; = CP 48/80 = bileşik 48/80. (B) Bar belirtilen konsantrasyonları ile Ionomycin (IM), dinitrophenol-insan serum albumin (DNP) ve bileşik 48/80 (Cp 48/80) stimülasyon sonra β-hexosaminidase yayın bazal koşullar (Spont), altında gösteren yüzdesi grafikle. Tahlil yinelenen içinde gerçekleştirildi; hata çubukları ortalama standart hatasını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MC modelleri, MC degranulation, kemotaksis, adezyon, de hücre içi sinyal iletim yollarının MC harekete geçirmek içinde yer aydınlatmak için çalışmaya başarıyla kullanılabilir. Kullanım insan MCs modelleri, ölümsüzleştirdi hatları (LAD2 ve HMC1) veya insan MCs gibi türetilen kablosunu ve bazı araştırmacılar kan progenitör hücreler (CD133 +) ve periferik kan progenitör hücreler (CD34 +). Diğerleri kemirgen MC modelleri, (sıçan bazofilik lösemi RBL - 2 H 3 MC satır) gibi ölümsüzleştirilmiş veya birincil kültürlü tercih (MCs BMMCs, PMCs kemik iliği türevi mouse) modelleri. Fare birincil MCs MC işlev belirli genler ve kodlanmış proteinler fizyolojik fonksiyonları keşfi için altın standart yaklaşım çok sayıda "knock-out" fare modelleri analiz etmek için kullanılabilir. Farmakolojik araçlar için yeterli seçicilik ve etki gücü açığı bu yöntem MC harekete geçirmek18tarafından özellikle sinyal iletim mekanizmaları soruşturma için değerli yapan. Fare PMCs bir olgun Morfoloji ve yüksek parçalı yapı sergileyen bağ dokusu fenotip vardır. Sadece iyi BMMCs gibi FcεRI antijen polietilenin cevap değil ama aynı zamanda birkaç ek reseptörleri endotelin 1 gibi veya bileşik 48 agonistler tarafından aktif hale gelir. Ancak, PMCs verim genellikle önemli ölçüde BMMCs kıyasla düşüktür ve genellikle bir Western blot ya da çok sayıda hücreleri gerektiren tekniklerden gerçekleştirmek için yeterli değildir. Çeşitli teknikler yalıtım ve PMCs arınma için tarif edilmistir. Örneğin, Percoll degrade Santrifüjü hücreleri19yüksek saflıkta verim rapor edilmiştir; Ancak, bu tekniği ile elde edilen hücre sayısı genellikle nispeten azdır. Burada açıklanan iletişim kuralında, periton boşluğu üzerinden hücre süspansiyon aspirasyon en kritik bir adımdır. Kan kirlenme örnek kaçınarak ve orta mümkün maksimal miktarı aspirating PMCs yüksek saflık yüksek bir dizi elde etmek için gereklidir. Bazı fare suşları ile maksimal PMC numarası sadece elde edilir bir kısaltılmış (11-12 gün) tarafından kodlamayla dönemi. Daha uzun bir süre cep numarasını bir azalma yol açar bu hücreler kültür koşullarında bırakarak kaldırılmış olabilir.
Mevcut çalışma, biz basit bir protokol son derece saf bir MC nüfus fare periton boşluğundan elde etmek olanaklı kılan olgun MCs izolasyonu için uygun tarif. Elde edilen hücreleri tarafından yüksek homojenliği ile karakterizedir ve belirli işaret reseptörleri (KIT ve FcεRI) ifadesi gibi tipik MC özellikleri sergilemek. Bu hücreler açıkça degranulate ve onların [Ca2 +]ben FcɛRI ve MRGPR harekete geçirmek karşılık olarak artırmak için MC karakteristik sergi.
MC sıkıca [Ca2 +]i düzeyine Ca2 + hücre içi mağaza ve Ca2 + giriş plazma zarı kanalları üzerinden yayınlamasını tarafından belirlenen ilgili sinyal. [Ca2 +] ben ayrıcalık bu tetikleyici MC degranulation bir kompleks hücre içi sinyal yollar etkinleştirir. Telaşlı olmayan diğer hücreler olduğu gibi ana Ca2 + akını MCs içinde tükenmesi Ca2 +tarafından aktive SOCE yoludur-depolar. Bu sinyal yolu dahil kanalları tanımlaması MC işlevi Yönetmeliği anlamak için önemlidir. SOCE yolu moleküler bileşenlerinin tanımlaması için floresan Ca2 + göstergeleri ve "yama-kelepçe" elektrofizyolojik yaklaşımı kullanan microfluorometric tekniği önemli bir rol oynadı. Ancak, [Ca2 +] düzeyiben yükselmesine, Ca2 + yayın ve SOCE toplamıdır. Bu iki aşamalı Ca2 + mobilizasyon ayırımcılık için sözde "Ca2 + yeniden ekleme" Protokolü (için gözden geçirme bkz: kuş ve ark. 200820) daha önce geliştirilmiştir. Bu protokol için dış tuz solüsyonu bir için normal [Ca2 +]o (1-2 mM) içeren açık bir sözde Ca2 +-ücretsiz çözüm. Bu koşullar altında hücreleri Ca2 + mağazaları boş ve böylece tam SOCE etkinleştirmek için thapsigargin ile tedavi edilir. Yokluğunda ekstraselüler Ca2 +, Ca2 + iyonları serbest intrasellüler Ca2 + mağazalardan yansıtan geçici [Ca2 +]ben yükseltilmesine, thapsigargin tedavi çağrıştırıyor. Yeniden ekleme ekstraselüler Ca2 + SOCE temsil eden [Ca2 +]ben bir artış yol açar. Bu makalede, biz SOCE içinde MCs karakterizasyonu için bu yaklaşımın başarılı kullanımı mevcut. [Ca2 +]ben değişiklikleri izlemek için Fura-2 kalsiyum göstergesi olarak kullanıldı. Acetoxymethyl haliyle, Fura-2 PMCs içinde kolayca yüklenebilir. Vahşi türü/nakavt analiz etmek için özellikle önemli olan sadece genlikleri [Ca2 +] yükselmelerben , aynı zamanda bazal [Ca2 +]ben düzeyleri, farklılıkları karşılaştırma bu ratiometric boya kullanımı sağlar hücreleri. Genetik olarak kodlanmış floresan boyalar ile Fura-2 ana dezavantajları biri farklı hücre organelleri ve böylece onun yüksek birikimi sitoplazmik floresans kirlenme karşılaştırılır.
Fura-2 görüntüleme bir çift uyarma tekniği gerektirir. Genellikle, çok harekete geçirilen bir ışık kaynağı kullanımını sadece ama ayrıca bir filtre tekerlek ya da emisyon ışık yolunu bir resim splitter katılımı gerektirir çift emisyon tekniğinden kullanmak teknik olarak daha kolaydır. Açıklanan protokol Ca2 + görüntüleme için heyecanlı olmayan diğer hücre kullanılabilir.
Bir ana MCs büyük miktarda arabulucu ve immunomodulatory maddeler doldurulur elektron yoğun salgı granül yüksek içeriklerinin özelliğidir. MC harekete geçirmek ön şekillendirilmesi granül bileşikler hızlı bir serbest bırakmak için yol açar. MC degranulation vitro analiz etmek için çeşitli yaklaşımlar mevcuttur, radiolabeled serotonin tespiti, histamin algılama antikorlar (ELISA) ve artış plazma membran yüzey kullanımının tespiti gibi elektrofizyolojik "yama-kelepçe" hücre kapasitans ölçümleri. Bugünkü gazetede yayımlanan vitro β-hexosaminidase çok iyi Renkölçer algılama kullanarak testin bir pratik uygulama açıklar. Bu tahlil β-hexosaminidase yeteneği terminal Nhidrolize üzerinde dayanır-asetil-D-hexosamine artıkları n-asetil-β-D-hexosaminides21. Β-hexosaminidase histamin ile aynı zamanda Cathepsin D veya TNF gibi diğer arabulucu ile birlikte yayınlanır ve böylece bir ilişkili degranulation MCs12,22salgı veziküller birden çok tür için kullanılabilir.
Açıklanan tekniği, PMCs farklı secretagogues, supernatants bir tahmin yanı sıra granül β-hexosaminidase İçindekiler tepkilerini β-hexosaminidase substrat ile birlikte takip ile 37 ° C'de teşvik. Substrat 4-Nitrophenyl N-asetil-β-D-glucosaminide kullanıldı. N-asetil-D-glucosamine ve p- nitrophenol hidrolize. P- nitrophenol miktarını colorimetrically, 405 ışık absorbans tarafından sayısal nm. Bazı değişiklikleri β-hexosaminidase yayın testin, 4-methylumbelliferil-N-asetil -beta- glucosamine bir substrat kullanılır. Enzimatik hidroliz sonra madde fluorometrically algılanabilir bir bileşik oluşturur. Degranulation ölçüde açıklaması, toplam içeriği için normalleştirilmiş bir yüzdesi olarak ifade. Bu bizi tanıştırmak yanında farklı hücre sayıları ve taneli içeriklerini çeşitli hücre hazırlıkları arasında değişkenlik önlemek izin verdi. Biz değil çıkarın (MCs secretagogues yokluğunda gözlenen) spontan yayınlamasını net uyarılan degranulation, spontan bir yayın ayrı ayrı MC canlılığı bir göstergesi olarak önemini nedeniyle rapor edildi beri. Tahlil sonuçlarında yüksek değişkenlik önlemek için çok dikkatli bir şekilde supernatants ve pellets teşvik hücreleri Santrifüjü sonra ayırmak önemlidir. Renkölçer ölçümleri gerçekleştirmeden önce çok iyi plakaları herhangi bir kabarcıkları oluşumunu önlemek için önemlidir. Önemli bir sınırlama açıklanan yöntemin sonucu bir mutlak değer olarak değil, ancak yayımlanan arabulucu yüzdesi olarak temsil edilir var.
Yayımlanan serotonin veya histamin doğrudan algılama yöntemleri, aksine bildirilen tahlil çok daha düşük maliyetli ve hiçbir özel ekipman gerektirir. Buna ek olarak, açıklanan tekniği son derece tekrarlanabilir, radyoaktif bir laboratuarda gerçekleştirilmesi gerekmez ve satın alma pahalı antikorların gerektirmez. Bu nedenle, daha pahalı ve zor teknikleri için mükemmel bir alternatif olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Yazarlar Julia Geminn mast hücresi hazırlık ve kültür teknik yardım almak için kabul etmek istiyorum. Bu eser Transregional ortak araştırma merkezi tarafından (TR-SFB) 152 desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI Medium | Thermo Scientific | 21875034 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | 14190144 | |
| FCS | Thermo Scientific | R92157 | |
| IL-3 | R&D Systems | 403-ML | |
| SCF | Thermo Scientific | PMC2115 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | C2272 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer Scientific | F1221 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | |
| DNP-HSA | Sigma-Aldrich | A6661 | |
| Anti-DNP-Antibody | Sigma-Aldrich | D-8406 | |
| Penstrep | Thermo Scientific | 15140122 | |
| Compound 48/80 | Sigma-Aldrich | C2313 | |
| 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol | Sigma-Aldrich | X100 | |
| 4-Nitrophenyl 2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside | Sigma-Aldrich | N9376 | |
| CoverWell Imaging Chamber | Sigma-Aldrich | GBL635051 | |
| 96-Well plate, v-shaped bottom | Corning | 3896 | |
| 96-Well plates, flat bottom | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Microtiter plate reader with "i-control" software | Tecan | Nano Quant, infinite M200 Pro | |
| Flat bottom plate | Greiner Bio-One | 655180 | |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I9657 | |
| 50 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62.547.254 | |
| Culture Flasks (25 cm) | Greiner Bio-One | 69160 | |
| Cover slips glasses round; ø 25 mm; No. 1 | Menzel | CB00250RA1 | |
| Hemocytometer | VWR | 631-0696 | |
| Inverted Microscope | Zeiss | Observer Z1 | |
| Objectiv Fluar 40x/1.3 Oil | Zeiss | 440260-9900 | |
| HC Filter Set Fura 2 | AHF | H76-521 | |
| CCD Camera | Zeiss | AxioCam MRm | |
| Monochromatic Light Source | Sutter Instruments | Lambda DG-4 | |
| Imaging Acquisition Program | Zeiss | AxioVision 4.8.2 | |
| Gravity fed solution application system | Custom Made | 4-channel | |
| 15 mL Plastic Centrifuge Tubes | Sarstedt | 62,554,502 | |
| Bench Centrifuge | Heraeus | Megafuge 1.0R |
References
- Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat Rev Immunol. 8 (6), 478-486 (2008).
- Feyerabend, T. B., et al. Cre-mediated cell ablation contests mast cell contribution in models of antibody- and T cell-mediated autoimmunity. Immunity. 35 (5), 832-844 (2011).
- Razin, E., Cordon-Cardo, C., Good, R. A. Growth of a pure population of mouse mast cells in vitro with conditioned medium derived from concanavalin A-stimulated splenocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (4), 2559-2561 (1981).
- Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The kit ligand, stem cell factor. Adv Immunol. 55, 1-96 (1994).
- Galli, S. J., et al. Mast cells as "tunable" effector and immunoregulatory cells: recent advances. Annu Rev Immunol. 23, 749-786 (2005).
- Ma, H. T., Beaven, M. A. Regulators of Ca(2+) signaling in mast cells: Potential targets for treatment of mast cell-related diseases. Adv Exp Med Biol. 716, 62-90 (2011).
- Vig, M., et al. Defective mast cell effector functions in mice lacking the CRACM1 pore subunit of store-operated calcium release-activated calcium channels. Nat Immunol. 9 (1), 89-96 (2008).
- Freichel, M., Almering, J., Tsvilovskyy, V. The role of TRP proteins in mast cells. Front Immunol. 3, 150 (2014).
- Scholten, J., et al. Mast cell-specific Cre/loxP-mediated recombination in vivo. Transgenic Res. 17 (2), 307-315 (2008).
- Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: An in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. J Immunol. 178 (10), 6465-6475 (2007).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Schwartz, L. B., Austen, K. F., Wasserman, S. I. Immunologic release of beta-hexosaminidase and beta-glucuronidase from purified rat serosal mast cells. J Immunol. 123 (4), 1445-1450 (1979).
- Schafer, B., et al. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J Allergy Clin Immunol. 131 (2), 541-549 (2013).
- Maurer, M., et al. Mast cells promote homeostasis by limiting endothelin-1-induced toxicity. Nature. 432 (7016), 512-516 (2004).
- Maurer, M., Church, M. K. Inflammatory skin responses induced by icatibant injection are mast cell mediated and attenuated by H(1)-antihistamines. Exp Dermatol. 21 (1), 154-155 (2012).
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Gaudenzio, N., et al. Different activation signals induce distinct mast cell degranulation strategies. J Clin Invest. 126 (10), 3981-3998 (2016).
- Solis-Lopez, A., et al. Analysis of TRPV channel activation by stimulation of FCepsilonRI and MRGPR receptors in mouse peritoneal mast cells. PLoS One. 12 (2), 0171366 (2017).
- Enerback, L., Svensson, I. Isolation of rat peritoneal mast cells by centrifugation on density gradients of Percoll. J Immunol Methods. 39 (1-2), 135-145 (1980).
- Bird, G. S., DeHaven, W. I., Smyth, J. T., Putney, J. W. Methods for studying store-operated calcium entry. Methods. 46 (3), 204-212 (2008).
- Aronson, N. N., Kuranda, M. J. Lysosomal degradation of Asn-linked glycoproteins. FASEB J. 3 (14), 2615-2622 (1989).
- Moon, T. C., Befus, A. D., Kulka, M. Mast cell mediators: their differential release and the secretory pathways involved. Front Immunol. 5, 569 (2014).
