성인 귀 피부에 대 한 전체 실장 Confocal 현미경 검사 법: 신경-혈관 분기 Morphogenesis 및 면역 세포 분포를 연구 하는 모델 시스템
Summary
여기, 분기 morphogenesis 면역 세포 분포 뿐만 아니라 주변 신경 및 혈관의 패턴을 시각화 수 있습니다 전체 성인 마우스 귀 피부에 높은 해상도 전체 마운트 이미징 방법을 설명 합니다.
Abstract
여기, 우리는 전체 산 성인 귀 피부 세포 수준에서 면역 세포 분포 뿐 아니라 포괄적인 3 차원 신경-혈관 분기 morphogenesis 패턴화, 공부 하 기술 이미징의 프로토콜 제시. 성인 조직에 주변 신경 및 혈관 해 부 구조 분석 기능 신경-혈관 배선 및 상처 치유 등의 병 적인 상태에 신경-혈관 변성의 이해에 몇 가지 통찰력을 제공합니다. 매우 유익한 모델 시스템으로 우리 해 부에 쉽게 접근할 수 있는 성인 귀 피부에 우리의 연구를 집중 했다. 전체 피부, 말 초 신경 (감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 세포), 혈관 (내 피 세포와 혈관 평활 근 세포에서에서 세포 구성 성분의 정확한 묘사를 제공 하는 우리의 간단 하 고 재현 가능한 프로토콜 ), 그리고 선 동적인 세포. 우리는이 프로토콜 주변 신경 및 혈관에 있는 형태학 적 이상 뿐만 아니라 다른 병 적인 조건 하에서 성인 귀 피부에 염증을 조사 하는 방법을 포장 됩니다 믿습니다.
Introduction
피부는 3 개의 층으로 이루어져: 표 피, 진 피 및 hypodermis. 그것은 줄기 세포 유지 보수, 차별화, 및 개발으로 재생, tumorigenesis, 및 성인에서 염증 morphogenesis 공부를 모델 시스템으로 사용 되었습니다. 피부 나가도록 풍부한 이며 innervated 주변 신경 및 혈관 시스템의 개발은 잘 조정 되도록 합니다.
우리는 이전 여러 라벨 그대로 주변 신경 및 혈관 그들의 세포질 구성 요소1,2,3, 를 포함 하 여 공부를 함께 전체-마운트 배아 피부 이미징 기술을 증명 하고있다 4: 감각 축 삭, 공감 축 삭, Schwann 신경 세포, 내 피 세포, pericytes, 및 혈관에 혈관 부드러운 근육 세포 (VSMCs). 신생, 동안 기본 모 세관 네트워크 집중적인 혈관 개장 겪 습와 계층적 혈관 분기 네트워크로 개발. 개발 진 피 하거나 hypodermis 동맥 말 초 감각 신경 및 혈관 분기 다음 동맥에 인접 한 양식. 계층적 혈관 네트워크는 철저 하 게 VSMCs 덮여, 후 교감 신경 따라 확장 하 고 큰 직경 혈관1,,56을 자극. 개발 신경 및 혈관 시스템 사이 가까운 협회에 중요성에도 불구 하 고 주요 질문 성인에서 다양 한 병 적인 상황에서 신경-혈관 네트워크에 어떻게 해결 되었습니다. 3-차원 고해상도 영상 해부학 인식할 수 분기 morphogenesis 및 패터 닝 pathogenesis 감사 필요가 있다.
성인 마우스 피부에서 신경 및 혈관 morphogenesis 조직 섹션 얼룩에 의해 일반적으로 분석 된다. 다른 연구 주변 신경 및 혈관, 모 낭, 피지 선 땀 샘, 및 arrector pili 근육7,,89시각화 하 피부 전체 마운트 이미지를 사용 했습니다. 그러나, 성인 피부 두께 전체 깊이에 피부를 분석 하기 어려운 하 게 했다.
현재 연구에서 우리는 이러한 과제를 극복 하기 위해 성인 귀 피부의 새로운 고해상도 전체 마운트 이미징 개발. 귀 피부는 쉽게 액세스할 수 해 부 및 피부 이후 전체 마운트 이미징에 대 한 그것의 전체 깊이 통해. 따라서, 포괄적인 부 량 측정, 피부에 주변 신경 및 혈관 시스템의 3 차원 구조를 비교에 적용 될 수 있는 간단 하 고 매우 재현 방법입니다. 우리는 큰 직경 혈관 주변 감각 및 교감 신경의 맞춤 성인 피부에서 유지 됩니다 설명 했다. 이 프로토콜의 목표는 분기 morphogenesis, 및 주변 신경 및 혈관, 뿐만 아니라 염증 등 다양 한 조건에서 성인 마우스 모델에서 세포 수준에서 면역 세포 분포의 패턴을 시각화 하 고 재생입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜 성인 귀 피부 신경-혈관 구조와 면역 세포 분포의 분석에 대 한 전체-마운트 immunonohistochemical 영상을 설명합니다. 우리는이 방법은 장점이 수많은 실험 연구자 분기 morphogenesis 주변 신경 및 혈관의 패턴화와 면역 세포와 머리를 포함 하 여 피부 구성의 3 차원 분포 연구에 대 한 생각 모 공입니다. 화상의 결과 추가 정량 분석에 대 한 이미징 소프트웨어를 사용 하 여 측정할 수 있습니다…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리 실험실 관리 K. 길 감사, 기술 지원, 제이 호킨스와 직원의 국립 보건원 (NIH) 건물 50 동물 마우스 관심과 R. 리드와 지원에 대 한 시설과 관리 지원에 대 한 F. Baldrey. 공유 감사 미 링크를 사와 M. Udey에 또한 그들의 귀 피부 해 부 프로토콜, 편집 도움말 및 줄기 세포 연구실의 구성원에 대 한 명. 화상 및 기술 도움말 및 사려깊은 토론에 대 한 신경-혈관 생물학. 토니 야 마자 키 과학 진흥 (JSP) NIH-KAITOKU에 대 한 일본 사회에 의해 지원 되었다. 이 작품은 국가 심 혼, 폐, 혈액 연구소 (HL005702-11 사원)의 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
Riferimenti
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