Whole-mount Microscopía Confocal para el oído adulto piel: un sistema modelo para el estudio de morfogénesis Neuro-vascular de ramificación y distribución de células inmunes
Summary
Aquí, describimos un método imagenológico de alta resolución Monte todo en la piel de oreja de ratón adulto entero, que nos permite visualizar la ramificación de la morfogénesis y el patrón de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como distribución de células inmunes.
Abstract
Aquí, presentamos un protocolo de una piel de oreja adulto todo montaje de técnica para estudiar la completa morfogénesis tridimensional de ramificación neuro-vascular y patrones, así como distribución de célula inmune a nivel celular. El análisis de estructuras anatómicas del nervio y los vasos sanguíneos periféricos en tejidos adultos proporciona algunas perspectivas en la comprensión del cableado neuro-vasculares funcional y degeneración neuro-vascular en condiciones patológicas como la cicatrización de heridas. Como un sistema modelo muy informativo, nos hemos centrado nuestros estudios en piel de oreja adulto, que es fácilmente accesible para la disección. Nuestro protocolo simple y reproducible proporciona una descripción exacta de los componentes celulares de la piel entera, tales como los nervios periféricos (axones sensoriales, axones simpáticos y células de Schwann), los vasos sanguíneos (células endoteliales y células musculares lisas vasculares ) y células inflamatorias. Creemos que este protocolo allanará el camino para investigar anormalidades morfológicas en los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la inflamación en la piel de oreja adulto bajo diferentes condiciones patológicas.
Introduction
Piel se compone de tres capas: la epidermis, la dermis y la hipodermis. Se ha utilizado como sistema modelo para estudiar el mantenimiento de la célula de vástago, la diferenciación y la morfogénesis en el desarrollo así como la regeneración, tumorogénesis e inflamación en adulto. Piel es ricamente vascularizada e inervada de tal manera que el desarrollo del sistema vascular y sistema nervioso periférico es bien coordinado.
Previamente hemos demostrado una técnica de imagen de piel embrionaria todo Monte con etiquetas múltiples para el estudio de los nervios periféricos intactos y los vasos sanguíneos incluyendo sus componentes celulares1,2,3, 4: axones sensoriales, axones simpáticos, las células en los nervios de Schwann, células endoteliales, pericitos y células musculares lisas vasculares (VSMCs) en los vasos sanguíneos. Durante la angiogénesis, una red capilar primaria experimenta intensivo remodelado vascular y se convierte en una red jerárquica de ramificación vascular. En la dermis/hipodermis en vías de desarrollo, las arterias ramifican junto a los nervios sensoriales periféricos y venas entonces forman adyacentes a las arterias. Después de la red vascular jerárquica está bien cubierta con VSMCs, los nervios simpáticos se extienden a lo largo e inervan los vasos sanguíneos de gran diámetro1,5,6. A pesar de la importancia de la estrecha asociación entre los sistemas nerviosos y vasculares en desarrollo, ha sido una cuestión importante abordar lo que ocurre con las redes neuro-vasculares en diferentes situaciones patológicas en adultos. Una proyección de imagen de alta resolución tridimensional es necesario apreciar la patogenesia, junto con morfogénesis ramificación anatómica reconocible y patrones.
Morfogénesis neuronal y vascular en piel de ratón adulto se analizan comúnmente por tejido sección coloración. Otros estudios han utilizado proyección de imagen de conjunto de montaje de la piel para visualizar los nervios periféricos y vasos sanguíneos, además de los folículos pilosos, glándulas sebáceas y del arrector pili músculos7,8,9. Sin embargo, el grueso de la piel adulta ha hecho difícil analizar la piel en toda su profundidad.
En el presente estudio, hemos desarrollado una novela alta resolución montaje en toda la proyección de imagen de piel de oreja adulto para superar estos desafíos. Piel del oído es fácilmente accesible para la disección y posterior montaje de toda la proyección de imagen de la piel en toda su profundidad. Por lo tanto, es un método simple y altamente reproducible que puede aplicarse para comparar la arquitectura tridimensional de los sistemas nerviosos y vasculares periféricos en la piel, con las medidas de cuantificación integral. Hemos demostrado que la alineación de los nervios periféricos sensoriales y simpáticas con los vasos sanguíneos de gran diámetro se conserva en la piel adulta. El objetivo de este protocolo es visualizar la ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución de células inmune a nivel celular en modelos de ratón adulto en varias condiciones tales como la inflamación y regeneración.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe la imagen de conjunto-Monte immunonohistochemical de piel de oreja adulto para el análisis de estructuras neuro-vasculares y la distribución de células inmunitarias. Creemos que este método tiene numerosas ventajas experimentales para investigadores para el estudio de ramificación de la morfogénesis y los patrones de los nervios periféricos y vasos sanguíneos, así como la distribución tridimensional de los componentes de la piel incluyendo el pelo y las células inmunes folículos. Los r…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos la gestión del laboratorio K. Gill y soporte técnico, J. Hawkins y el personal de institutos nacionales de salud (NIH) facilidad del edificio 50 animales para la ayuda del ratón, y R. Reed y F. Baldrey para asistencia administrativa. Gracias también a Motegi S. y M. Udey para compartir su oído piel disección Protocolo N. quemaduras ayuda editorial y los miembros del laboratorio de células madre y biología Neuro-Vascular para la ayuda técnica y discusión reflexiva. T. Yamazaki fue apoyada por la sociedad japonesa para la promoción de la ciencia (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabajo fue financiado por el programa de investigación intramuros de la National Heart, Lung and Blood Institute (HL005702-11 para Y.M.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
Riferimenti
- Mukouyama, Y. S., Shin, D., Britsch, S., Taniguchi, M., Anderson, D. J. Sensory nerves determine the pattern of arterial differentiation and blood vessel branching in the skin. Cell. 109, 693-705 (2002).
- Mukouyama, Y. S., James, J., Nam, J., Uchida, Y. Whole-mount confocal microscopy for vascular branching morphogenesis. Methods Mol Biol. 843, 69-78 (2012).
- Li, W., Mukouyama, Y. S. Whole-mount immunohistochemical analysis for embryonic limb skin vasculature: a model system to study vascular branching morphogenesis in embryo. J Vis Exp. , (2011).
- Yamazaki, T., et al. Tissue Myeloid Progenitors Differentiate into Pericytes through TGF-beta Signaling in Developing Skin Vasculature. Cell Rep. 18, 2991-3004 (2017).
- Mukouyama, Y. S. Vessel-dependent recruitment of sympathetic axons: looking for innervation in all the right places. J Clin Invest. 124, 2855-2857 (2014).
- Li, W., et al. Peripheral nerve-derived CXCL12 and VEGF-A regulate the patterning of arterial vessel branching in developing limb skin. Dev Cell. 24, 359-371 (2013).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. , e51749 (2014).
- Salz, L., Driskell, R. R. Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin. J Vis Exp. , (2017).
- Liakath-Ali, K., et al. Novel skin phenotypes revealed by a genome-wide mouse reverse genetic screen. Nat Commun. 5, 3540 (2014).
- Gunawan, M., et al. The methyltransferase Ezh2 controls cell adhesion and migration through direct methylation of the extranuclear regulatory protein talin. Nat Immunol. 16, 505-516 (2015).
- Avci, P., et al. Animal models of skin disease for drug discovery. Expert Opin Drug Dis. 8, 331-355 (2013).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S. Animal models of atopic dermatitis. J Invest Dermatol. 129, 31-40 (2009).
- Wagner, E. F., Schonthaler, H. B., Guinea-Viniegra, J., Tschachler, E. Psoriasis: what we have learned from mouse models. Nat Rev Rheumatol. 6, 704-714 (2010).
- Nunan, R., Harding, K. G., Martin, P. Clinical challenges of chronic wounds: searching for an optimal animal model to recapitulate their complexity. Dis Model Mech. 7, 1205-1213 (2014).
- O’Brien, P. D., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. Mouse models of diabetic neuropathy. ILAR J. 54, 259-272 (2014).
- Yamazaki, T., et al. Whole-Mount Adult Ear Skin Imaging Reveals Defective Neuro-Vascular Branching Morphogenesis in Obese and Type 2 Diabetic Mouse Models. Sci Rep. 8, (2018).
