Toda a montagem em microscopia Confocal para pele da orelha do adulto: um sistema de modelo para estudar a morfogênese Neuro-vasculares de ramificação e distribuição de células imunes
Summary
Aqui, descrevemos um método de imagem de toda a montagem de alta resolução da pele de orelha inteira rato adulto, que nos permite visualizar ramificação morfogênese e padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes.
Abstract
Aqui, apresentamos um protocolo de uma pele de orelha do adulto de toda a montagem de imagem técnica para estudo abrangente tridimensional neuro-vascular ramificação morfogênese e padronização, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular. A análise das estruturas anatômicas nervos e dos vasos sanguíneos periféricas em tecidos adultos fornece alguns insights sobre a compreensão da fiação neuro-vascular funcional e degeneração neuro-vascular em condições patológicas como a cicatrização de feridas. Como um sistema modelo altamente informativa, focamos nossos estudos na pele da orelha do adulto, que é facilmente acessível para dissecação. Nosso protocolo simples e reprodutível fornece uma descrição exata dos componentes celulares da pele inteira, tais como os nervos periféricos (axônios sensoriais, simpáticos axônios e células de Schwann), vasos sanguíneos (células endoteliais e células de músculo liso vascular ) e células inflamatórias. Acreditamos que este protocolo irá pavimentar o caminho para investigar as anormalidades morfológicas nos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a inflamação da pele da orelha do adulto sob diferentes condições patológicas.
Introduction
Pele é composta por três camadas: epiderme, derme e hipoderme. Ela tem sido usada como um sistema modelo para estudar a manutenção de células-tronco, diferenciação e morfogênese em desenvolvimento, bem como a regeneração tumorigênese e inflamação em adultos. Pele é ricamente vascularizada e inervada tal que o desenvolvimento do sistema vascular e sistema nervoso periférico é bem coordenado.
Nós demonstramos anteriormente uma técnica de imagem de montagem em toda a pele embrionária com múltiplos rotulagem para estudar os nervos periféricos intactos e os vasos sanguíneos, incluindo seus componentes celulares1,2,3, 4: axônios sensoriais, simpáticos axônios, células em nervos Schwann, células endoteliais, pericitos e células de músculo liso vascular (VSMCs) nos vasos sanguíneos. Durante a angiogênese, uma rede capilar primária sofre remodelação vascular intensivo e se desenvolve em uma rede hierárquica de ramificação vascular. Na derme/hipoderme em desenvolvimento, as artérias ramificam ao lado de veias e nervos sensoriais periféricos dão forma então adjacentes às artérias. Depois que a rede vascular hierárquica é completamente coberta com VSMCs, nervos simpáticos se estendem ao longo e inervam os vasos sanguíneos de grande diâmetro1,5,6. Apesar da importância da associação estreita entre os sistemas nervosos e vasculares em desenvolvimento, uma grande questão tem sido a abordar o que acontece com as redes neuro-vascular em diversas situações patológicas em adultos. Uma imagem tridimensional de alta resolução é necessária apreciar a patogênese, juntamente com a morfogênese ramificação anatomicamente reconhecível e padronização.
Morfogênese neuronal e vascular em pele de rato adulto é comumente analisada pela coloração de secção de tecido. Outros estudos utilizaram imagens de toda a montagem da pele para visualizar os nervos periféricos e dos vasos sanguíneos, além dos folículos pilosos, glândulas sebáceas e arrector pili músculos7,8,9. No entanto, a espessura da pele adulta tornou difícil analisar a pele ao longo de toda a sua profundidade.
No presente estudo, nós desenvolvemos uma romance de alta resolução de imagem toda a montagem da pele da orelha do adulto para superar estes desafios. Pele da orelha é prontamente acessível para dissecção e subsequente de imagem de toda a montagem da pele ao longo de toda a sua profundidade. Assim, é um método simples e altamente reprodutível que pode ser aplicado para comparar a arquitetura tridimensional dos sistemas nervoso e vasculares periféricas na pele, com medidas de quantificação abrangente. Demonstrámos que o alinhamento dos nervos periféricos sensoriais e simpáticos com os vasos sanguíneos de grande diâmetro é preservado na pele adulta. O objetivo do presente protocolo é Visualizar ramificação morfogênese e a padronização dos nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição de células imunes a um nível celular em modelos do rato adulto em várias condições, tais como inflamação e regeneração.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve a imagem de toda a montagem immunonohistochemical de pele de orelha do adulto para a análise das estruturas neuro-vasculares e distribuição de células imunes. Acreditamos que este método tem várias vantagens experimentais aos pesquisadores estudar ramificação morfogênese e a padronização de nervos periféricos e os vasos sanguíneos, bem como a distribuição tridimensional dos componentes da pele, incluindo o cabelo e células do sistema imunológico folículos. Os resultados da imagem…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a K. Gill para a gestão do laboratório e suporte técnico, J. Hawkins e os funcionários dos institutos nacionais de saúde (NIH) facilidade do edifício 50 animais de assistência com cuidados de rato e R. Reed e F. Bernardo para assistência administrativa. Obrigado também a Motegi S. e M. Udey por compartilhar o seu protocolo de dissecação de pele orelha, s. Burns para ajuda editorial e membros do laboratório de células-tronco e biologia Neuro-Vascular para ajuda técnica e discussão pensativo. T. Yamazaki foi apoiado pela sociedade de Japão para a promoção da ciência (JSPS) NIH-KAITOKU. Este trabalho foi financiado pelo programa de pesquisa Intramural de nacional do coração, pulmão e Instituto de sangue (HL005702-11 para Y.M.)
Materials
| 10 x Phosphate Buffered Saline | KD Medical | RGE-3210 | PBS, without Ca2+/Mg2+ |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Gibco | 14025-092 | HBSS, with Ca2+/Mg2+ |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, fixative, diluted in PBS |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Detergent |
| Normal goat serum | Gibco | 16210064 | Component of blocking/washing buffer |
| Normal donkey serum | Jackson Immuno research | 017-000-121 | Component of blocking/washing buffer |
| Curved fine tweezers | Dumont | RS-5047 | |
| Curved tweezers | Integra Miltex Vantage | V918-782, V918-784 | |
| Filter Unit 0.45 mm | Thermo Scientific | 157-0045 | For filtration |
| 1 mL syringe | Coviden | 8881501400 | For filtration |
| Syringe filter Unit 0.22 mm | Millex-GV | SLGVR04NL | For filtration |
| ProLong Gold | Thermo Scientific | P36934 | Anti-fade mounting medium |
| Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 | |
| Photoshop CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Illustrator CC 2017 | Adobe | Graphics editor software | |
| Image J | NIH | Image processing software | |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | Millipore | MAB1398Z | Hamster IgG, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-PECAM-1 (CD31) antibody | BD Pharmingen | 553369 | Rat IgG2a kappa, vascular endothelial cell marker, 1:300 |
| Anti-aSMA antibody conjugated with cy-3 | Sigma | C6198 | Mouse IgG2a, vascular smooth muscle cell marker, 1:500 |
| Anti-EphB1 antibody | Santa Cruz | sc-9319 | Goat polyclonal, venous endothelial cell marker, 1:100 |
| Anti-neuron-specific Class III b-tubulin (Tuj1) | Abcam | AB18207 | Tuj1, Rabbit polyclonal IgG, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-Tuj1 antibody | Covance | MMS-435P | Mouse IgG2a, pan-axonal marker, 1:500 |
| Anti-MBP antibody | Abcam | AB40390 | Rabbit polyclonal IgG, myelination marker, 1:200 |
| Anti-Tyrosine Hydroxylase antibody | Chemicon | AB152 | Rabbit polyclonal, sympathetic neuron marker, 1:500 |
| Anti-Peripherin antibody | Chemicon | AB1530 | Rabbit polyclonal, peripheral neuron marker, 1:1000 |
| Anti-CD11b antibody | Bio-Rad | MCA74G | Rat IgG2b, inflammatory cell marker (macrophages), 1:50 |
| Anti-CD45 antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0451-85 | Rat IgG2b kappa, pan-hematopoietic cell marker, 1:500 |
| Anti-CD3 antibody | Bio-Rad | MCA1477T | Rat IgG1, immune cell marker, 1:100 |
| Anti-CD45R (B220) antibody | Thermo Fisher Scientific | 14-0452 | Rat IgG2a kappa, inflammatory cell marker, 1:200 |
| Anti-GFP antibody | Thermo Fisher Scientific | A11122 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab13970 | Chicken polyclonal, 1:500 |
| Anti-b-gal antibody | Cappel | 55976 | Rabbit polyclonal, 1:5000 |
| Anti-RFP antibody | Abcam | Ab62341 | Rabbit polyclonal, 1:300 |
| Goat anti-rabbit IgG (H+L) Alexa 488 | Thermo Fisher Scientific | A11034 | Rabbit polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-hamster IgG (H+L) Alexa 647 | Jackson Immuno research | 127-605-160 | Hamster polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-rat IgG (H+L) Alexa 594 | Jackson Immuno research | 112-585-167 | Rat polyclonal secondary antibody, 1:250 |
| Goat anti-mouse IgG2a Alexa 633 | Thermo Fisher Scientific | A21136 | Mouse IgG2a secondary antibody, 1:250 |
Riferimenti
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