Une autre approche pour étudier les événements primaires dans la neurodégénérescence utilisant des coupes de cerveau de Rat Ex Vivo
Summary
Nous présentons une méthode qui peut donner un aperçu de l’événements précoces qui sous-tendent la neurodégénérescence davantage et basée sur la technique de cerveau établies ex vivo , combinant les avantages des expériences in vivo et in vitro . En outre, il représente une occasion unique pour une comparaison directe du groupe traité et non traité dans le même plan anatomique.
Abstract
Malgré les nombreuses études qui visent à développer des modèles animaux fiables qui soit le principal processus neurodégénérescence sous-jacent, très peu ont été largement acceptées. Ici, nous vous proposons une nouvelle procédure adaptée de la célèbre ex vivo cerveau tranche technique, qui offre une plus étroite en vivo-comme scénario que les préparations in vitro , pour étudier les premiers événements déclenchant la dégénérescence des cellules, comme observés dans la maladie d’Alzheimer (ma). Cette variation se compose des étapes simples et facilement reproductibles, qui permettent la préservation de la cytoarchitecture anatomique de la région du cerveau sélectionné et ses fonctionnalités locales dans un milieu physiologique. On trouvera différentes zones anatomiques du cerveau même, qui donne la possibilité d’effectuer des expériences multiples avec les traitements en question dans un site, dose et fonction du temps. Les limites potentielles qui pourraient affecter les résultats associés à cette méthodologie sont liées à la conservation du tissu, c’est-à-dire le maintien de son intégrité anatomique pendant les opérations de tranchage et d’incubation et de l’épaisseur de coupe, qui peut influencer l’analyse biochimique et immunohistochimiques. Cette approche peut être utilisée à différentes fins, p. ex., examiner les mécanismes moléculaires impliqués dans des conditions physiologiques ou pathologiques, dépistage des drogues ou des essais de dose-réponse. Enfin, ce protocole pourrait également réduire le nombre d’animaux utilisés dans les études comportementales. L’application rapportée ici a été récemment décrite et testée pour la première fois sur ex vivo rat tranches de cerveau contenant le prosencéphale basal (BF), qui est l’une des régions cérébrales touchées principalement dans AD. Plus précisément, il a été démontré que l’administration d’un peptide toxique provenant de l’extrémité C-terminale de l’acétylcholinestérase (AChE) pourrait inciter un profil AD, déclenchant, le long de l’axe antéro-postérieur de la BF, une expression différentielle de altérée dans AD, tels que le récepteur nicotinique alpha7 (α7-CNCDH), les protéines phosphorylées Tau (p-Tau) et la protéine bêta-amyloïde (Aß).
Introduction
AD est qu’une pathologie chronique caractérisée par l’atteinte neurodégénérative progressive affectant les zones du cerveau différentes, comme le cortex entorhinal (EC), BF, hippocampe (HC) et bulbe olfactif (OB)1,2,3, 4,5. Les derniers stades de développement AD mener à un déclin cognitif progressif, faisant de cette maladie la forme la plus courante de démence, représentant environ 70 % de tous les cas6. Malgré les tentatives étendues pour comprendre les étapes initiales causant des AD, il n’est pas actuellement une indication expérimentale définie élucider leur. En outre, la théorie la plus populaire – le « hypothèse amyloïde » – est plus en plus contestée car elle ne fournit pas un profil complet pour expliquer la pathobiologie de l’AD, ni une cible pharmaceutique qui s’est avéré efficace7,8 ,,9.
Une autre théorie qui reçoit une attention croissante suggère que les mécanismes initiaux au cours de la neurodégénérescence sont associés à un cluster neuronal principalement sensible aux AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. ce hub cellulaire hétérogène compris dans les projets BF, mésencéphale et le tronc cérébral, à plusieurs régions, tels que les EC et SC OB15,16. Malgré sa diversité dans la morphologie neuronale et la synthèse des neurotransmetteurs, ce noyau de cellules partage une caractéristique commune pour exprimer la douleur, qui peut également avoir une fonction non enzymatique17,18. Ce rôle non classiques comme un roman de signalisation molécule intervient dans le flux de calcium (Ca2 +) dans les neurones qui peuvent subir des événements trophiques ou toxiques en ce qui concerne le Ca2 + dose, disponibilité et neuronale âge17,18 , 19.
Au cours de la neurodégénérescence, la perte cellulaire observée serait donc associée à cette fonction non enzymatique17,18,20, qui est imputable à un peptide 30mer (T30) clivé de l’extrémité C AChE 20. en accord avec les résultats précédents, bord de culture cellulaire et préparations des21 de18,d’imagerie optique, nous avons démontré, à travers une approche originale basée sur ex vivo rat tranches de cerveau contenant des structures BF, qui provoquaient T30 un profil AD22. Plus précisément, cette nouvelle méthode offre un scénario plus physiologique que culture cellulaire puisqu’il conserve bon nombre des caractéristiques d’un tissu intact, allant d’anatomiques à la préservation des circuits, quoique pour une fenêtre de temps d’heures. Nous avons appliqué ce protocole pour examiner les événements qui se déroulent durant les premières phases de la neurodégénérescence, suivi de la réponse aiguë T30 sur demande.
Malgré le vaste corpus de littérature sur l’utilisation de cerveau, tranches d’enquêter sur les voies moléculaires implicitement dans les dommages neuronaux ou neurogenèse23,24, ce protocole prévoit pour la première fois un plus immédiat et sensible à la lecture par rapport à l’usage commun des tranches organotypique. Toutefois, comme c’est le cas pour organotypique sections du cerveau, cette procédure tranche aiguë peut également être adoptée à diverses fins, telles que l’évaluation des neuroprotecteurs ou molécules neurotoxiques, découverte des principaux changements moléculaires qui se produisent dans un processus spécifique, l’analyse immunohistochimique et essais pharmacologiques pour le système nerveux central les pathologies liées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le principal aspect du présent protocole, basé sur la technique de cerveau bien établie ex vivo , permet de tester simultanément deux hemislices spéculaires, obtenus à partir d’un même plan anatomique, surveiller leur réponse après l’application d’une particulière condition (contrôler ou traités) ; Cela offre donc un paradigme expérimental contrôlé aussi étroitement que possible. La possibilité d’évaluer à un temps, dose et ponctuelle, de sorte différente neurochimiques liés à l’…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par Neuro-Bio Ltd. Nous tenons à remercier le Dr Giovanni Ferrati et Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) pour leurs commentaires et conseils sur le manuscrit.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
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