Un enfoque alternativo para estudiar acontecimientos primarios en neurodegeneración con rodajas de cerebro de rata Ex Vivo
Summary
Se presenta un método que puede proporcionar más información sobre los eventos principios subyacentes a la neurodegeneración y basado en la técnica de cerebro establecido ex vivo , combinando las ventajas de los experimentos en vivo y en vitro . Además, representa una oportunidad única para comparación directa del grupo tratado y no tratado en el mismo plano anatómico.
Abstract
A pesar de numerosos estudios que intentan desarrollar modelos animales confiables que refleja la primaria procesos de neurodegeneración subyacente, muy pocos han sido ampliamente aceptados. Aquí, proponemos un nuevo procedimiento de adaptación de la conocida ex vivo cerebro rebanada técnica, que ofrece un más de cerca en vivo-como escenario de preparativos en vitro , para investigar los acontecimientos tempranos provocando degeneración de célula, como observado en la enfermedad de Alzheimer (AD). Esta variación consiste en pasos simples y fácilmente reproducibles, que permiten la preservación de la Citoarquitectura anatómico de la región seleccionada del cerebro y su funcionalidad local en un medio fisiológico. Pueden obtenerse diferentes áreas anatómicas del cerebro mismo, brindando la oportunidad de realizar múltiples experimentos con los tratamientos en cuestión en un sitio, dosis y forma dependiente del tiempo. Limitaciones potenciales que puedan afectar a los resultados relacionados con esta metodología se relacionan con la conservación del tejido, es decir, el mantenimiento de su integridad anatómica durante los pasos de incubación y corte y el espesor de la sección, que puede influir en el bioquímico y el análisis immunohistochemical. Este enfoque puede ser empleado para diferentes fines, como explorar mecanismos moleculares implicados en condiciones fisiológicas o patológicas, detección de drogas o ensayos dosis-respuesta. Por último, este protocolo también podría reducir el número de animales empleados en estudios de comportamiento. La aplicación aquí ha sido recientemente descrita y probado por primera vez en vivo ex rebanadas de cerebro rata, que contiene el prosencéfalo basal (BF), que es una de las regiones cerebrales afectadas principalmente en AD. En concreto, se ha demostrado que la administración de un péptido tóxico derivado de la c-terminal de la acetilcolinesterasa (AChE) podría sugerirán el un anuncio como perfil, disparo, a lo largo del eje antero-posterior del BF, una expresión diferencial de las proteínas alteradas en DC, como el receptor nicotínico alpha7 (α7-nAChR), fosforilada (P-tau) del Tau y amiloide beta (Aβ).
Introduction
AD es que una patología crónica caracterizada por deterioro neurodegenerativo progresivo que afecta a diversas áreas del cerebro, tales como la corteza entorrinal (CE), BF, hipocampo (HC) y el bulbo olfatorio (OB)1,2,3, 4,5. Las etapas finales de desarrollo AD conducen a un deterioro cognitivo progresivo, que esta enfermedad la forma más común de demencia, representando aproximadamente el 70% de los casos6. A pesar de intentos amplia para entender las etapas iniciales que causan AD, no hay actualmente una indicación experimental definida elucidarlos. Además, la teoría más popular – la “hipótesis del amiloide” – es cada vez más puesta en duda ya que no provee un perfil completo en la explicación de la Patobiología de la AD, ni un objetivo farmacéutico que ha demostrado ser eficaz7,8 ,9.
Una teoría alternativa que está recibiendo atención cada vez mayor sugiere que los mecanismos iniciales que ocurren durante la neurodegeneración están relacionados con un grupo neuronal principalmente susceptible en AD3,10,11 , 12 , 13 , 14. el rodete celular heterogéneo englobado dentro de los proyectos BF, mesencéfalo y médula oblonga, para varias regiones, tales como la CE, HC y OB15,16. A pesar de su diversidad en la morfología neuronal y la síntesis del neurotransmisor, este núcleo de células comparte una característica común en la expresión de dolor, que puede tener también una función no-enzimática17,18. Este papel no clásico como una novela de señalización molécula media flujo de calcio (Ca2 +) en las neuronas que puede someterse a eventos tóxicos o tróficos en relación con la dosis de Ca2 + y la disponibilidad neuronal edad17,18 , 19.
Durante la neurodegeneración, la pérdida celular observada podría ser, por tanto, asociada a esta función no enzimática17,18,20, que es atribuible a un péptido 30mer (T30) troceado de la C-terminal de dolor 20. en consonancia con los resultados anteriores, en cultivo celular y óptica de18,21 preparados, hemos demostrado, a través de un novedoso enfoque basado en ex vivo las rebanadas de cerebro de rata en que contienen estructuras BF, que T30 un perfil de AD-como22. En concreto, esta nueva metodología ofrece un escenario más fisiológico que la cultura de célula ya que mantiene muchas de las características de un tejido intacto, desde anatómicos a la preservación de los circuitos, aunque para una ventana de tiempo de horas. Hemos aplicado este protocolo para explorar los eventos que tienen lugar durante las primeras fases de la neurodegeneración, monitoreo de la respuesta aguda al T30 aplicación.
A pesar del gran cuerpo de literatura sobre el uso de cerebro rebanadas para investigar vías moleculares implicadas en el daño neuronal o neurogénesis23,24, este protocolo proporciona por primera vez una más inmediata y sensible a la lectura en comparación con para el uso común de organotypic rebanadas. Sin embargo, como es el caso de organotypic secciones del cerebro, este procedimiento de rebanada aguda puede también adoptar para varios propósitos, tales como la evaluación de neuroprotectores o moléculas neurotóxicas, descubrimiento de primarios cambios moleculares que ocurren en un proceso específico, el análisis de immunohistochemical y ensayos farmacológicos para el sistema nervioso central relacionados con patologías.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aspecto principal de este protocolo, basado en la técnica de cerebro bien establecida ex vivo , permite probar sincrónicamente dos hemislices especulares, obtenidos en el mismo plano anatómico, monitoreo de la respuesta después de la aplicación de un específico condición de control o tratamiento; por lo tanto ofrece un paradigma experimental controlado tan ajustadamente como sea posible. La posibilidad de evaluar en un tiempo, dosis y forma específica diferentes neuroquímicos relacionados con el dete…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por Neuro-Bio Ltd. Nos gustaría agradecer al Dr. Giovanni Ferrati y Dr. Sergio Rotondo (Neuro-Bio) por sus comentarios y consejos sobre el manuscrito.
Materials
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich, Germany | S7653 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich, Germany | P9333 | Reagent for aCSF preparation |
| Sodium bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich, Germany | S5761 | Reagent for aCSF preparation |
| Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O)) | Sigma-Aldrich, Germany | 63138 | Reagent for aCSF preparation |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich, Germany | P5655 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes salt | Sigma-Aldrich, Germany | H7006 | Reagent for aCSF preparation |
| Hepes acid | Sigma-Aldrich, Germany | H3375 | Reagent for aCSF preparation |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Germany | G7528 | Reagent for aCSF preparation |
| Calcium chloride dehydrate | Sigma-Aldrich, Germany | 223506 | Reagent for aCSF preparation |
| T30 peptide | Genosphere Biotechnologies, France | AChE-derived peptide tested | |
| Surgical dissecting kit | World Precision Instruments, USA | Item #: MOUSEKIT | Brain removal step |
| Surgical blades | Swann-Morton, UK | BS 2982 | Brain removal step |
| Filter paper | Fisher Scientific, USA | 11566873 | Brain preparation for slicing |
| Glue | Brain preparation for slicing | ||
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000 S | Slicing |
| Brushes | Tissue handling | ||
| Oxygen canister | Sectioning and incubation phase | ||
| 1x Phosphate buffer saline (PBS) | Fisher Scientific, USA | BP2438-4 | Homogenization step |
| Phosphatase inhibitors | Fisher Scientific, USA | 1284-1650 | Homogenization step |
| Protease inhibitors | Roche complete PIC, USA | 4693116001 | Homogenization step |
| Pestles | Starlab, UK | I1415-5390 | Homogenization step |
| Microcentrifuge | |||
| Pierce 660 nm Protein Assay | Thermo Scientific, USA | 22660 | Protein concentration |
Riferimenti
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).
- Schliebs, R. Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer’s disease–interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling. Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).
- Schmitz, T. W., et al. Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer’s pathology. Nature Communications. 7, 13249 (2016).
- Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer’s disease on the cerebral cortex and the hippocampus. Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).
- Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. Olfactory centres in Alzheimer’s disease: olfactory bulb is involved in early Braak’s stages. Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).
- Winblad, B., et al. Defeating Alzheimer’s disease and other dementias: a priority for European science and society. The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).
- Herrup, K. The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis. Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).
- De Strooper, B., Karran, E. The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease. Cell. 164 (4), 603-615 (2016).
- Scheltens, P., et al. Alzheimer’s disease. Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).
- Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer’s disease resemble embryonic development-A study of molecular forms. Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).
- Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. Alzheimer’s disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies. Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).
- Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. Early neurone loss in Alzheimer’s disease: cortical or subcortical?. Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).
- Mesulam, M. The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer’s Disease: Pivotal Factor or Side Show?. Learn Mem. , 43-49 (2004).
- Schliebs, R., Arendt, T. The cholinergic system in aging and neuronal degeneration. Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).
- Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6). Neuroscienze. 10 (4), 1185-1201 (1983).
- Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey. J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).
- Greenfield, S. Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat. Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).
- Garcia-Ratés, S., et al. (I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains. Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).
- Eimerl, S., Schramm, M. The quantity of calcium that appears to induce neuronal death. Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).
- Greenfield, S., Vaux, D. J. Commentary Parkinson’s Disease, Alzheimer’s Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism. Science. 113 (3), 485-492 (2002).
- Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. (II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator. Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).
- Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer’s Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).
- Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscienze. 305, 86-98 (2015).
- Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).
- Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia. Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).
- Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway. Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).
- Grinvald, A., Hildesheim, R. VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics. Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).
- Badin, A. S., John, E., Susan, G. High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases. Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).
- Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function. Neurophotonics. 4, 31213 (2017).
- Opitz-Araya, X., Barria, A. Organotypic hippocampal slice cultures. Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).
- Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain. Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).
