En rask og lettvint rørledning for generering Genomic punkt mutanter i C. elegans bruker CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Her presenterer vi en metode for å ingeniør genomet C. elegans ved hjelp av CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins og homologi avhengige reparasjon maler.
Abstract
Gruppert regelmessig avbrutt palindromic gjentakelser (CRISPR) – CRISPR – tilknyttede protein 9 (Cas9) prokaryote adaptive immunsystemet forsvar har vært medforfatter valgt som et kraftig verktøy for presis eukaryote genomet engineering. Her presenterer vi en rask og enkel metode bruke chimeric enkelt guide RNAs (sgRNA) og CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) for effektiv og presis generering av genomisk punkt mutasjoner i C. elegans. Vi beskriver en rørledning for sgRNA Målvalg, homologi-rettet reparasjon (HDR) mal tegning, CRISPR-Cas9-RNP complexing og levering og en genotyperingteknologi strategi som gir robust og rapid identifikasjon av riktig redigerte dyr. Vår tilnærming ikke bare tillater den lettvinte generasjon og identifikasjon av ønsket genomisk punkt mutant dyr, men også forenkler påvisning av andre komplekse indel alleler i ca 4-5 dager med høy effektivitet og en redusert screening arbeidsmengde.
Introduction
Nyere teknologiske fremskritt har radikalt forvandlet og akselerert evnen til å nøyaktig ingeniør genomer. Spesielt har CRISPR-Cas9 systemet, som er avhenger av RNA-guidede endonuclease Cas9 å indusere en dobbel strand pause (DSB) nær målet sekvensen av interesse, vært mye brukt nøyaktig ingeniør genomet av flertallet av modell i biomedisinsk forskning1,2,3,4. Betydelig, bruk av CRISPR-Cas9 har ulåst genomet redigering selv i vanskelige arter som C. elegans5. Uansett art, generere punkt mutasjoner med CRISPR-Cas9 basert genomet redigering system avhengig tre kjerne-komponenter: 1) Cas9 endonuclease, 2) en enkelt hjelpelinje RNA (sgRNA) som leder Cas9 endonuclease en mål-sekvens, og 3) brukeren utformet homologi-rettet reparasjon (HDR) mal som inneholder ønsket edit(s) interesse2.
Det finnes flere metoder som kan brukes til å introdusere rettet mot sgRNA og Cas9 nuclease i cellene plasmider, RNA og viral basert levering metoder6. Nylig direkte levering av pre-kompleksbundet sgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) har dukket opp som en kraftfull og effektiv verktøyet i CRISPR-Cas9-baserte genomet redigering7. Direkte levering av pre-kompleksbundet CRISPR-Cas9-RNPs har flere forskjellige fordeler, nemlig: 1) RNPs omgå behovet for mobilnettet transkripsjon og oversettelse, 2) RNPs fjernes raskt, som kan øke spesifisitet ved å redusere tilgjengelig tid for off-målet cleavage og 3) RNPs inneholder ingen fremmede DNA/RNA elementer som omgår innføring av ikke-innfødte sekvenser i vert genomet gjennom tilfeldige integrering. Disse attributtene sannsynlig utgjør sammen en kortvarig briste på målet CRISPR redigering samtidig minimere off-målet effekter.
Vi beskriver en enkel og effektiv protokoll for områdespesifikke genomisk endringer i C. elegans. Denne protokollen inkluderer målretting sgRNA og enkelt strandet oligonucleotide (ssODN) HDR mal tegning, sgRNA-Cas9 RNP complexing og levering, og en genotyperingteknologi strategi for utvetydig identifikasjon av riktig redigerte dyr. Bruker denne strategien, ikke bare kan de områdespesifikke endringene gjenopprettes, men andre ikke-spesifikke indel mutasjoner kan også gjenopprettes. Dermed vår strategi tillater generering av en allel serie med en enkelt strategi, der både mono-allel, bi-allel og indel mutanter kan genereres i F1 generasjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPR-Cas9 systemet er et kraftig og effektiv verktøy for å presist endre genomet av modellen organismer. Her viser vi at chimeric sgRNAs20 kombinert med ssODN HDR kan høyeffektive generering av genomisk punkt mutasjoner i C. elegans. Viktigere, viser vi at RNP levering produserer høy redigering effektivitet når fluorescens som en co markøren, opplyser det enkel og pålitelig teknikken.
Fleste av CRISPR-Cas9 C. elegans genomet engineering er avh…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Det er ingen konflikter av interesse knyttet til denne rapporten.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
