السريع وخط أنابيب سهلة "توليد طفرات نقطة الجينوم" في C. ايليجانس باستخدام كريسبر/Cas9 "ريبونوكليوبروتينس"
Summary
هنا، نقدم أسلوب هندسة الجينوم من C. ايليجانس باستخدام ريبونوكليوبروتينس كريسبر-Cas9 وقوالب إصلاح يعتمد التماثل.
Abstract
يكرر المتناوب اينتيرسبيرسيد بانتظام متفاوت المسافات (كريسبر)-كريسبر-المرتبطة البروتين 9 (Cas9) نظام الدفاع المناعي التكيفي بدائية يختارهم كأداة قوية لهندسة الجينوم حقيقية النواة الدقيقة. وهنا نقدم طريقة سريعة وبسيطة باستخدام الكشف دليل واحد تشيميريك (سجرنا) وكريسبر-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) لتوليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسكفاءة ودقة. يصف لنا خط أنابيب لاختيار الأهداف سجرنا وإصلاح موجه التماثل (HDR) قالب تصميم، إلى كريسبر-Cas9-رنب والتسليم واستراتيجية التنميط التي تمكن من تحديد هوية قوية وسريعة من الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح. نهجنا لا يسمح بتوليد السطحية وتحديد نقطة الجينوم المطلوب الحيوانات المسخ فحسب، بل أيضا يسهل الكشف عن الآليلات إينديل معقدة أخرى في حوالي 4-5 أيام مع الكفاءة العالية وفحص خفض عبء عمل.
Introduction
جذريا حولت التطورات التكنولوجية الحديثة وتسريع القدرة على الضبط مهندس الجينوم. على وجه الخصوص، النظام كريسبر-Cas9، الذي يعتمد على اندونوكليسي الموجهة بالحمض النووي الريبي Cas9 لحمل فاصل حبلا مزدوجة (جهاز تسوية المنازعات) قرب تسلسل الهدف الفائدة، قد استخدمت على نطاق واسع دقة هندسة الجينوم الأغلبية من طراز الكائنات المستخدمة في بحوث الطب الأحيائي1،2،،من34. إلى حد كبير، وقد مقفلة استخدام كريسبر-Cas9 الجينوم التحرير حتى في الأنواع الصعبة مثل ايليجانس جيم-5. بغض النظر عن الأنواع، تولد الطفرات مع الجينوم كريسبر-Cas9 على أساس تحرير النظام يعتمد على ثلاثة عناصر أساسية: 1) Cas9 اندونوكليسي, 2) دليل واحد الحمض النووي الريبي (سجرنا) الذي يوجه اندونوكليسي Cas9 إلى تسلسل مستهدفة، ومستخدم 3) تصميم إصلاح موجه التماثل (HDR) قالب يحتوي على edit(s) المطلوب لمصلحة2.
وهناك العديد من الطرق التي يمكن استخدامها لإدخال استهداف سجرنا و Cas9 نوكلاس داخل الخلايا بما في ذلك بلازميد، والجيش الملكي النيبالي، والفيروسية على أساس التسليم أساليب6. في الآونة الأخيرة، برز التسليم المباشر من قبل الرصاصية سجرنا-Cas9 ريبونوكليوبروتينس (رنبس) كأداة قوية وفعالة في الجينوم كريسبر-Cas9-تعتمد تحرير7. التسليم المباشر من قبل الرصاصية كريسبر-Cas9 “رنبس” له العديد من المزايا المتميزة، إلا وهي: 1) رنبس تجاوز الحاجة إلى النسخ الخلوية وسرعة مسح الترجمة، 2) رنبس، التي قد تزيد من خصوصية بتخفيض الوقت المتاح ل إيقاف المستهدفة الانقسام، و 3) رنبس يحتوي على لا عناصر أجنبية في الحمض النووي/الحمض النووي الريبي التي تلتف الأخذ بتسلسل غير أصلية في مجال المجين المضيف من خلال التكامل عشوائي. معا، هذه السمات يحتمل تقديم انفجار لم تدم طويلاً لتحرير كريسبر على الهدف مع التقليل من الآثار خارج الهدف.
يمكننا وصف بروتوكول بسيطة وفعالة لإدخال تغييرات الجينوم الخاصة بالموقع في C. ايليجانس. ويشمل هذا البروتوكول تستهدف سجرنا وتصميم قالب واحد اليغنوكليوتيد الذين تقطعت بهم السبل (سودن) تقرير التنمية البشرية، وإلى رنب سجرنا-Cas9 والتسليم، واستراتيجية الوراثي لتحديد الحيوانات تم تحريرها بشكل صحيح لا لبس فيه. باستخدام هذه الاستراتيجية، ليس فقط يمكن استرداد التغييرات المطلوبة الخاصة بالموقع، ولكن يمكن أيضا استرداد الطفرات إينديل غير محددة أخرى. وهكذا، استراتيجيتنا تصاريح توليد سلسلة الاليلي استخدام استراتيجية واحدة، حيثما مونو الاليلي، استقصاء المعلومات الجينية على حد سواء، ويمكن أن تتولد طفرات إينديل في الجيل1 و.
Protocol
Representative Results
Discussion
نظام كريسبر-Cas9 أداة قوية وفعالة لتعديل التحديد الجينوم من طراز الكائنات الحية. هنا، علينا أن نظهر أن سجرناس تشيميريك20 مقترنة بتمكين قوالب HDR سودن توليد الطفرات الجينوم في C. ايليجانسذات كفاءة عالية. الأهم من ذلك، نبدي أن التسليم رنب تنتج عالية الكفاءة التحرير عندما يتم اس…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
لا يوجد أي تضارب في المصالح المتصلة بهذا التقرير.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
