Eine schnelle und Facile Pipeline für die Erzeugung von Genomic Punkt Mutanten in C. Elegans verwenden CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins
Summary
Hier präsentieren wir eine Methode, um das Genom von C. Elegans Ingenieur CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins und Homologie abhängigen Reparatur Vorlagen.
Abstract
Die gruppierten regelmäßig eingestreuten palindromischen Wiederholungen (CRISPR) – CRISPR – assoziierten Protein 9 (Cas9) prokaryotische adaptive Immunabwehr als ein mächtiges Werkzeug für präzise eukaryotische Genom Engineering kooptiert worden hat. Hier präsentieren wir Ihnen eine schnelle und einfache Methode mit Chimären einzelne Guide RNAs (SgRNA) und CRISPR-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) für die effiziente und präzise Generation von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wir beschreiben eine Pipeline für SgRNA Zielauswahl, unter der Regie von Homologie (HDR) Vorlage Reparaturverfahren CRISPR-Cas9-RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung-Strategie, die die robuste und schnelle Identifizierung von richtig bearbeiteten Tiere ermöglicht. Unser Ansatz ermöglicht die einfache Erzeugung und Identifizierung des gewünschten genomische Punkt mutierte Tiere nicht nur, sondern erleichtert auch den Nachweis von anderen komplexen Indel Allele in ca. 4-5 Tage mit hohem Wirkungsgrad und einer reduzierten Screening Arbeitsauslastung.
Introduction
Jüngsten technologischen Fortschritte haben radikal umgewandelt und beschleunigt die Fähigkeit, genau Ingenieur Genome. Insbesondere wurde das CRISPR-Cas9-System, das stützt sich auf die RNA-geführte Endonuklease Cas9 induzieren eine Doppelstrang-Pause (DSB) in der Nähe der Zielsequenz von Interesse, weitgehend verwendet, um genau das Genom der Mehrheit der verwendeten Modellorganismen Ingenieur Biomedizinische Forschung1,2,3,4. Bezeichnenderweise hat die Verwendung von CRISPR-Cas9 freigeschaltet Genom-Bearbeitung auch bei schwierigen Arten wie C. Elegans5. Unabhängig von der Spezies, Generierung von Punktmutationen mit dem Redaktionssystem CRISPR-Cas9 Basis-Genom stützt sich auf drei Kernkomponenten: (1) Cas9 Endonuklease, 2) einen einzigen Führer RNA (SgRNA), die Cas9 Endonuklease einer Zielsequenz und (3) ein Benutzer entwickelt, leitet unter der Regie von Homologie Reparatur (HDR) Vorlage mit dem gewünschten edit(s) von Interesse2.
Es gibt mehrere Methoden, die verwendet werden können, die gezielt SgRNA und Cas9 einzuführen Nuklease in Zellen einschließlich Plasmid, RNA und viral-basierte Lieferung Methoden6. Vor kurzem hat Direktlieferung von Pre-komplexiert SgRNA-Cas9 Ribonucleoproteins (RNPs) als ein leistungsfähiges und effizientes Werkzeug im CRISPR-Cas9-basierte Genom Bearbeitung7entstanden. Die direkte Zustellung von Pre-komplexiert CRISPR-Cas9-RNPs hat einige deutliche Vorteile, nämlich: (1) RNPs umgehen die Notwendigkeit einer zellulären Transkription und Übersetzung, 2) RNPs sind schnell gelöscht, Spezifität erhöhen durch Verringerung der zur Verfügung stehende Zeit für Ziel Spaltung und 3) RNPs enthalten keine fremden DNA/RNA-Elemente, die die Einführung von Gebietsfremden Sequenzen in das wirtsgenom durch zufällige Integration umgeht. Zusammen bieten diese Attribute wahrscheinlich eine kurzlebige Platzen der zielgerichtet CRISPR Bearbeitung bei gleichzeitiger Minimierung der Ziel-Effekte.
Ein einfaches und effizientes Protokoll für die Einführung von standortspezifischer genomischer Veränderungen in C. Elegansbeschrieben. Dieses Protokoll enthält targeting SgRNA und einzelne gestrandeten Oligonukleotid (SsODN)-HDR-Template-Design, SgRNA-Cas9 RNP Komplexbildner und Lieferung und eine Genotypisierung Strategie für die eindeutige Kennzeichnung der richtig bearbeiteten Tiere. Mit dieser Strategie, nicht nur die gewünschten Site-spezifische Änderungen zurückgewonnen werden, aber andere unspezifische Indel Mutationen können auch wiederhergestellt werden. So, unsere Strategie erlaubt die Generation der ein Allel Serie mit einer einheitlichen Strategie, wo Mono-Allele, Bi-Allel und Indel Mutanten in der F-1 Generation erzeugt werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das CRISPR-Cas9-System ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für präzise Änderung des Genoms von Modellorganismen. Hier zeigen wir die Chimäre SgRNAs20 in Verbindung mit SsODN HDR Vorlagen ermöglichen hoch effiziente Erzeugung von genomischen Punktmutationen in C. Elegans. Wichtig ist, zeigen wir, dass RNP Lieferung hocheffiziente Bearbeitung erzeugt, wenn Fluoreszenz dient als ein Co Selektionsmarker, Hervorhebung der Benutzerfreundlichkeit und Zuverlässigkeit der Techn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Es gibt keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Bericht.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
References
- Dickinson, D. J., Goldstein, B. CRISPR-Based Methods for Caenorhabditis elegans Genome Engineering. Genetics. 202, 885-901 (2016).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346, 1258096 (2014).
- Ma, D., Liu, F. Genome Editing and Its Applications in Model Organisms. Genomics Proteomics Bioinformatics. 13, 336-344 (2015).
- Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32, 347-355 (2014).
- Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-Guided Genome Engineering in C. elegans. Curr Protoc Mol Biol. 115, 31-31 (2016).
- Yin, H., Kauffman, K. J., Anderson, D. G. Delivery technologies for genome editing. Nat Rev Drug Discov. 16, 387-399 (2017).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 24, 1012-1019 (2014).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17, 148 (2016).
- Paix, A., Folkmann, A., Seydoux, G. Precision genome editing using CRISPR-Cas9 and linear repair templates in C. elegans. Methods. , (2017).
- Prior, H., Jawad, A. K., MacConnachie, L., Beg, A. A. Highly Efficient, Rapid and Co-CRISPR-Independent Genome Editing in Caenorhabditis elegans. G3 (Bethesda). 7, 3693-3698 (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. PCR: The Polymerase Chain Reaction. J Vis Exp. , (2017).
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection. J Vis Exp. , (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. DNA Gel Electrophoresis . J Vis Exp. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Gel Purification. J Vis Exp. , (2017).
- Estrada-Rivadeneyra, D. Sanger sequencing. FEBS J. , (2017).
- Ludolph, A. C., Brettschneider, J., Weishaupt, J. H. Amyotrophic lateral sclerosis. Curr Opin Neurol. 25, 530-535 (2012).
- Evans, T. C. . WormBook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
- Boyd, S. D., et al. A Balanced Look at the Implications of Genomic (and Other "Omics") Testing for Disease Diagnosis and Clinical Care. Genes (Basel). 5, 748-766 (2014).
- Saccon, R. A., Bunton-Stasyshyn, R. K., Fisher, E. M., Fratta, P. Is SOD1 loss of function involved in amyotrophic lateral sclerosis?. Brain. 136, 2342-2358 (2013).
- Acevedo-Arozena, A., et al. A comprehensive assessment of the SOD1G93A low-copy transgenic mouse, which models human amyotrophic lateral sclerosis. Dis Model Mech. 4, 686-700 (2011).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
