Uma rápida e superficial Pipeline para gerar Genomic ponto mutantes em c. elegans usando CRISPR/Cas9 ribonucleoproteínas
Summary
Aqui, apresentamos um método para engenheiro do genoma de c. elegans usando CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas e modelos de reparo dependente de homologia.
Abstract
As repetições de palíndromos regularmente intercaladas em cluster (CRISPR) – CRISPR – proteína 9 (Cas9) sistema de defesa imune adaptativo procarióticas foi co-optado como uma poderosa ferramenta para a engenharia de precisão genoma eucariótico associada. Aqui, apresentamos um método rápido e simples, usando a guia único quimérico RNAs (sgRNA) e CRISPR-Cas9 ribonucleoproteínas (RNPs) para a geração eficiente e precisa de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Descrevemos um pipeline para seleção de alvo sgRNA, reparação de homologia-dirigido (HDR) modelo de design, complexantes CRISPR-Cas9-RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem que permita a identificação robusta e rápida dos animais corretamente editados. Nossa abordagem não só permite a geração fácil e a identificação do ponto desejado genômica animais mutantes, mas também facilita a detecção de outros alelos do complexo indel em aproximadamente 4-5 dias com eficiência elevada e uma carga de trabalho reduzida de triagem.
Introduction
Recentes avanços tecnológicos têm radicalmente transformada e acelerou a capacidade de genomas de engenheiro precisamente. Em particular, o sistema CRISPR-Cas9, que depende da endonuclease guiada por RNA Cas9 para induzir uma pausa de fita dupla (DSB) perto da sequência alvo do interesse, tem sido extensivamente usado para engenheiro com precisão o genoma da maioria dos organismos modelo usados no investigação biomédica1,2,3,4. Significativamente, o uso de CRISPR-Cas9 destravou genoma edição mesmo em espécies de difícil como c. elegans5. Independentemente da espécie, gerar mutações pontuais com o genoma de CRISPR-Cas9 baseado editando o sistema se baseia em três componentes principais: 1) Cas9 endonuclease, 2) um guia único RNA (sgRNA) que direciona a endonuclease Cas9 para uma sequência do alvo e 3) um usuário projetado modelo de reparação de homologia-dirigido (HDR) contendo o desejado edit(s) de juros2.
Existem vários métodos que podem ser usados para introduzir o direcionamento sgRNA e Cas9 nuclease em células incluindo plasmídeo, RNA e de métodos de entrega baseada em viral6. Recentemente, entrega direta de ribonucleoproteínas sgRNA pre-complexado-Cas9 (RNPs) surgiu como uma ferramenta poderosa e eficiente no genoma baseados em CRISPR-Cas9 edição7. A entrega direta de pre-complexado CRISPR-Cas9 RNPs tem várias vantagens distintas, a saber: 1) RNPs ignorar a necessidade de transcrição celular e tradução, 2) RNPs são limpas rapidamente, que pode aumentar a especificidade, reduzindo o tempo disponível para o alvo clivagem e 3) RNPs contêm elementos de DNA/RNA não estrangeiros que contorna a introdução de sequências não-nativas no genoma hospedeiro através da integração aleatória. Juntos, esses atributos prováveis fornecem uma rajada curta duração de edição de CRISPR no alvo, minimizando os efeitos fora do alvo.
Descreveremos um protocolo simples e eficiente para a introdução de alterações genômicas site-specific em c. elegans. Este protocolo inclui a segmentação sgRNA design de modelo HDR único encalhado do oligonucleotide (ssODN), sgRNA-Cas9 complexantes de RNP e entrega e uma estratégia de genotipagem para a identificação inequívoca dos animais devidamente editados. Usando essa estratégia, não só as alterações desejadas e site-specific podem ser recuperadas, mas outras mutações indel inespecíficos também podem ser recuperadas. Assim, nossa estratégia permite a geração de uma série alélica usando uma estratégia simples, onde ambos mono-alélica, bi-alélica e indel mutantes podem ser gerados na geração1 F.
Protocol
Representative Results
Discussion
O sistema CRISPR-Cas9 é uma ferramenta poderosa e eficaz para precisamente modificar o genoma de organismos modelo. Aqui, demonstramos que sgRNAs quimérico20 juntamente com ssODN HDR modelos habilitar a geração altamente eficiente de genômicas mutações pontuais em c. elegans. Importante, demonstramos que a entrega da RNP produz alta eficiência de edição quando fluorescência é usada como um marcador de seleção co, destacando a facilidade e confiabilidade da técnica.
<p c…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Há não há conflitos de interesse relacionados a este relatório.
Materials
| CRISPRevolution sgRNA EZ Kit | Synthego Inc. | chimeric sgRNA | |
| Nuclease-free TE | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| Nuclease-free water | Synthego Inc. | provided with the sgRNA kit EZ kit | |
| 4 nmole Ultramer DNA Oligo | Integrated DNA Technologies | ssODN HDR template | |
| Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1078728 | Cas9 protein |
| pCFJ90 | Addgene | 19327 | Pmyo-2::mCherry Marker Plasmid |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| DNA Clean & Concentrator | Zymo Research | D4004 | |
| Zymoclean Gel DNA Recovery Kit | Zymo Research | D4002 | |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix | New England Biolabs | M0494L | |
| Proteinase K | Sigma | P2308 | |
| Glass Borosilicate Glass Micropipettes | Sutter Instruments | BF100-78-10 | OD: 1.0mm. ID: 0.78mm |
| Trizma Hydrochloride | Sigma | T5941 | |
| MgCl2 | Sigma | M2393 | |
| NP-40 | Sigma | 74385 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-100 | |
| RNaseZap Decontamination Solution | Fisher Scientific | AM9780 |
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