هذا البروتوكول وصف أسلوب المنشأة حديثا لإيصال الفيروس إلى البروستاتا مورين. استخدام التكنولوجيا كريسبر/Cas9، overexpression الجينات، أو تسليم recombinase لجنة المساواة العرقية، التقنية تسمح التعديلات أورثوتوبيك التعبير الجيني ويطبق نموذج رواية ماوس لسرطان البروستاتا.
مع تزايد الإصابة بسرطان البروستاتا، تحديد برامج تشغيل جديدة لاستئصال ورم أو المغيرون أمر حاسم. نماذج الماوس المهندسة وراثيا (جيم) لسرطان البروستاتا تتعرقل بسبب التغايرية الورم ودينامياتها microevolution المعقدة. نماذج الماوس سرطان البروستاتا التقليدية تشمل، بين أمور أخرى، germline والشرطي بالضربة القاضية، والتعبير المعدلة وراثيا والمسرطنة ونماذج إكسينوجرافت. جيل طفرات حيثياته في هذه النماذج معقدة وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفا. وباﻹضافة إلى ذلك، تستهدف معظم النماذج التقليدية غالبية ظهارة البروستاتا، بينما من المعروف سرطان البروستاتا البشرية تتطور كحدث معزول في مجموعة فرعية صغيرة فقط من الخلايا. نماذج قيمة تحتاج إلى محاكاة ليس فقط بدء سرطان البروستاتا، ولكن أيضا التقدم إلى مرض متقدمة.
هنا يصف لنا أسلوباً لاستهداف خلايا قليلة في ظهارة البروستاتا بخلايا ترانسدوسينج بالجسيمات الفيروسية. تسليم الفيروسات المحورة للبروستاتا مورين يسمح تحوير الجينات في ابيثيليا البروستاتا. بموجب هذا سيحدد نوع الفيروس وكمية عدد الخلايا المستهدفة لتحوير الجينات التي ترانسدوسينج الخلايا قليلة لبدء السرطان والعديد من الخلايا للعلاج الجيني. عن طريق حقن المستندة إلى عملية جراحية في الفص الأمامي، البعيدة عن مسار البول، يمكن توسيع الورم في هذا النموذج دون الإخلال بوظيفة الجهاز البولي للحيوان. وعلاوة على ذلك، باستهداف مجموعة فرعية فقط من الخلايا الظهارية البروستاتا الأسلوب يتيح التوسع في الاستنساخ للورم، ويحاكي ذلك الشروع في الأورام البشرية، والتقدم، فضلا عن غزو من خلال الغشاء القاعدي.
هذا الأسلوب الرواية نموذجا سرطان البروستاتا قوية مع تحسين مدى صلة الفسيولوجية. الحيوانات تعاني محدودة، وحيث لا توجد تربية إضافية غير مطلوب، يتم تقليل عدد الحيوانات عموما. في الوقت نفسه، هو الإسراع في تحليل الجينات المرشحة الجديدة والممرات، التي هي بدورها أكثر فعالية من حيث التكلفة.
الكشف والعلاج من سرطان البروستاتا تحسنت إلى حد كبير خلال العقد الماضي. لا يزال، هو تزايد حالات الإصابة بسرطان البروستاتا، عقب متوسط العمر المتوقع. ما يقدر 1.1 مليون حالة جديدة في جميع أنحاء العالم، ومن بين الأسباب الأكثر شيوعاً للوفيات المتصلة بالسرطان في الرجال 1. سرطان البروستاتا بطيئة في تنميتها، ولكن عندما تقدمت السرطان المنتشر دولة متقدمة، التكهن الفقراء بسبب خيارات العلاج محدودة. حتى الآن، تم التعرف على الجينات قليلة فقط كبرامج مشتركة في هذا النوع من السرطان، وعن عدم التجانس ومولتيفوكاليتي يعوق الكشف عن المؤشرات الحيوية واستهدافها المرض السائقين2،3.
غالباً ما هي ضعف التقنيات الكلاسيكية لتوليد جيمس بالتعقيد والنفقات في الوقت المناسب، والتكاليف. نماذج مشروطة بالضربة القاضية قد استخدمت على نطاق واسع لدراسة الجينات المرشحة سرطان البروستاتا، أن تسفر عن الفتك الجنينية عند إلغاء تنشيطه ب الفعل4. النماذج الأكثر شيوعاً تشمل recombinase لجنة المساواة العرقية خاصة بالبروستاتا تحركها أما بروباسين معدلة5 أو مروج6 بسا المتكاملة في جيم واسطة التهجين إضافية. في هذه النماذج، سيتم استهداف الجين للفائدة في معظم الخلايا الظهارية البروستاتا، توليد تضخم في الجهاز كامل، التي قد تنال من الحيوان المسالك البولية الدالة7.
تسليم الفيروسية من البروتين لجنة المساواة العرقية عن طريق الحقن في الفص الأمامي من البروستات مورين يمكن حل هذه المشكلة باستهداف بعض الخلايا8فقط. مراعاة لمختبرات المتطلبات التقنية والخبرة، والأهداف، فوائد الأسلوب من طائفة واسعة من الاختلافات المحتملة. وقد تبين النهج الناجحة استخدام إتش استهداف جانب و فتن9 أو استهداف فتن و Trp5310 لينتيفيروس بين أمور أخرى. إضافة المتسلسلات، مثل لوسيفراس، في بناء الفيروسية أو جيم سيمكن علاوة على ذلك رصد تطور المرض عن طريق الإضاءة الحيوية التصوير11غير الغازية.
تحرير المجين على أساس تكنولوجيا كريسبر/Cas9 يكشف عن فرصة جديدة وسريعة لدراسة السرطان عن طريق توليد السريع للضربة القاضية جسدية12. تسليم الفيروسية دليل واحد الكشف (سجرناس) موجهة إلى الفص الأمامي من البروستات مورين ينشئ نموذجا أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لسرطان البروستاتا. بهذه الوسائل، يمكن أن تشكل الخلايا المفردة التي تحمل طفرات المختار الحيوانات المستنسخة التي قادرة على التوسع والغزو. وعلاوة على ذلك، سوف تولد استخدام دليل الكشف عن الجينات المستهدفة متعددة استنساخ الخلية مع التعديلات في جينات مختلفة. هذا سوف يسمح التغايرية الورم وضغط انتقاء الطبيعي في تطور السرطان، التي يمكن أن تكشف عن أهمية كل تحوير الجينات أو آليات ابيستاتيك.
هنا نقدم طريقة لتوصيل الجزيئات الفيروسية إلى البروستاتا مورين لتحوير الجينات. بشق البطن صغيرة، يتعرض الفص البروستاتا الأمامي مورين ويتم حقن الجسيمات الفيروسية الفص. خمسة أيام ويمكن إزالة مقاطع ما بعد الجراحة، والجراحة من الجلد وسرطان البروستاتا يمكن أن تحلل من 8 أسابيع بعد. وعموما، هذا هو إجراء سريع وفعال من حيث التكلفة، مما له أثر ضئيل على الماوس ويسمح الورم أكبر لتطوير دون المساس بالماوس.
في هذا البروتوكول، يصف لنا طريقة لتغيير التعبير الجيني في الفص الأمامي من البروستات موريني بحقن الفيروس، إنشاء نموذج ماوس جديدة قوية لسرطان البروستاتا (الشكل 2). ووصف الإدارة الناجحة إتش أولاً ليوو et al. ، في عام 20058. وقد أظهرنا سابقا كيف الترميز إتش لبروتين…
The authors have nothing to disclose.
ومولت السيد على زمالة من جمعية السرطان الدانماركية (R146-A9394-16-S2). ومولت مفب والشرائية من نوفا أف (AUFF-E-2015-FLS-9-8). شارك السيد ومفب مولت من مدرسة الدراسات العليا، والصحة، والاتحاد الأفريقي. المختبر E.F.W. معتمد من المنح المقدمة من وزارة الاقتصاد (SAF2015 70857، يشترك في تمويله سيطلب-الاتحاد الأوروبي) ومنسق المتقدم منحة (741888-منظمة التضامن المسيحي الدولية–المرح) الإسبانية.
نريد أن نشكر “ليليانا” فاجاردو ميلر (الجينات والتنمية والمرض؛ مركز أبحاث السرطان الوطني) لقراءة نقدية من المخطوطة.
Equipment | |||
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
Heating pad | multiple suppliers | ||
Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
Microscope | Leica | different models have been used | |
Reagents | |||
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
Antisedan | obtained from the animal facility | ||
Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
Midazolam | obtained from the animal facility | ||
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Eye ointment | Takeda | 7242 | |
Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |