Este protocolo descreve um método recentemente estabelecido para a entrega do vírus para a próstata murino. Usando tecnologia CRISPR/Cas9, superexpressão do gene ou entrega de recombinase Cre, a técnica permite ortotópico alteração da expressão gênica e implementa um modelo de romance do rato para câncer de próstata.
Com um aumento da incidência de câncer de próstata, identificação de novos drivers de tumor ou moduladores é crucial. Modelos de rato geneticamente modificados (GEMM) para câncer de próstata são dificultados pela heterogeneidade do tumor e sua dinâmica complexa de microevolução. Câncer de próstata tradicional rato modelos incluem, entre outros, da linha germinal e condicionais nocautes, transgénico expressão de oncogenes e modelos de enxerto. Geração de mutações de novo nesses modelos é complexa, demorada e dispendiosa. Além disso, a maioria dos modelos tradicionais alvo a maioria do epitélio da próstata, Considerando que o câncer de próstata humano é bem conhecido a evoluir como um evento isolado em apenas um pequeno subconjunto de células. Modelos valiosos precisa simular não só a iniciação do câncer de próstata, mas também progressão de doença avançada.
Aqui nós descrevemos um método para algumas células no epitélio da próstata por transducing células-alvo por partículas virais. A entrega de um vírus projetado para a próstata murino permite a alteração da expressão gênica no epitélio da próstata. Quantidade e tipo de vírus pelo presente irão definir o número de células alvo para a alteração do gene por transducing algumas células para iniciação de cancro e muitas células para a terapia de gene. Através de injeção com base em cirurgia no lóbulo anterior, distal da trilha urinária, o tumor neste modelo pode expandir sem prejudicar a função urinária do animal. Além disso, pela segmentação apenas um subconjunto de células epiteliais da próstata a técnica permite a expansão clonal do tumor e, portanto, imita a iniciação de tumor humano, progressão, bem como a invasão através da membrana basal.
Esta nova técnica fornece um modelo poderoso câncer de próstata com maior relevância fisiológica. Sofrimento dos animais é limitado, e desde que a procriação não adicional for necessária, contagem global animal é reduzida. Ao mesmo tempo, análise de novos genes candidatos e caminhos é acelerada, que, por sua vez, é mais custo eficiente.
Detecção e tratamento do câncer de próstata têm melhorado significativamente na última década. Ainda assim, a incidência de câncer de próstata está aumentando, seguindo a expectativa de vida. Com um estimado 1,1 milhões de novos casos em todo o mundo, está entre as causas mais comuns de morte por cancro em homens 1. Câncer de próstata é lento em seu desenvolvimento, mas quando o câncer progrediu para um estado metastático avançado, o prognóstico é pobre devido a opções de tratamento limitado. Até agora, apenas alguns genes têm sido identificados como os drivers comuns nesse tipo de câncer, e sua heterogeneidade e multifocality impede a deteção de biomarcadores e doença targetable motoristas2,3.
Técnicas clássicas de geração GEMMs são muitas vezes prejudicadas pela sua complexidade, oportunas despesas e custos. Modelos de nocaute condicionais foram amplamente utilizados para estudar os genes candidatos de câncer de próstata, que resultam em embrionária letalidade quando inativado no germline4. Modelos mais comuns envolvem uma recombinase Cre de específico da próstata guiado por qualquer um Probasin modificado5 ou um promotor de6 PSA integrado no GEMM por cruzamentos adicionais. Nestes modelos, o gene de interesse será orientado na maioria das células epiteliais da próstata, gerando hiperplasia no órgão inteiro, que pode prejudicar trato urinário função7 do animal.
Entrega viral da proteína Cre por injeção para o lobo anterior da próstata murino pode resolver esse problema, orientando apenas algumas células8. Os pré-requisitos técnicos de laboratórios, expertise e objectivos, tendo em conta os benefícios do método de uma ampla gama de variações possíveis. Abordagens de sucesso utilizando adenovírus visando JunB e Pten9 ou Lentivirus direcionamento Pten e Trp5310 foram mostradas entre outros. Adição de transgenes, tais como luciferase, para construção de viral ou o GEMM além disso permitirá monitoramento não-invasivo de progressão da doença através de bioluminescência imagem11.
Genoma de edição com base na tecnologia CRISPR/Cas9 revela uma oportunidade nova e rápida para estudar o câncer através de geração rápida de nocautes somática12. Viral entrega de RNAs de guia única (sgRNAs) direcionada para o lobo anterior da próstata murino estabelece um modelo fisiologicamente mais relevante do câncer de próstata. Por este meio, únicas pilhas carregando mutações escolhidas podem formar clones que são capazes de expansão e invasão. Além disso, o uso da guia RNAs para múltiplos genes alvo irá gerar clones de células com alterações em genes diferentes. Isso permitirá que a heterogeneidade do tumor e uma pressão de seleção natural na progressão do câncer, que pode revelar a importância de cada alteração do gene ou mecanismos epistatic.
Aqui nós apresentamos um método para entregar partículas virais para a próstata murino para alteração da expressão genética. Por uma pequena incisão abdominal, o lobo da próstata anterior murino é exposto e partículas virais são injetadas para o lobo. Cinco dias clipes pós-cirurgia, cirurgia podem ser retirados a pele e o câncer da próstata pode ser analisado de 8 semanas depois. Globalmente, este é um procedimento rápido e eficiente, que tem pouco impacto sobre o mouse e permite maior tumor desenvolver sem comprometer o mouse.
Neste protocolo, descrevemos um método para alterar a expressão do gene no lóbulo anterior da próstata murino pela injeção do vírus, criando um novo modelo de rato poderoso para câncer de próstata (Figura 2). A administração bem sucedida de um adenovírus foi primeiramente descrita por Leow et al . em 20058. Anteriormente mostramos como um adenovírus que codifica para uma proteína de recombinase Cre pode substituir demorado cruzamento de um alelo…
The authors have nothing to disclose.
Senhor foi financiado por uma bolsa de estudos da sociedade dinamarquesa do câncer (R146-A9394-16-S2). MFB e MKT foram financiados por AUFF NOVA (AUFF-E-2015-FLS-9-8). Senhor e MFB foram co-financiados pela escola de pós-graduação, saúde, AU. O laboratório E.F.W. é suportado por subvenções do Ministério espanhol de economia (SAF2015-70857, co-financiado pela União Europeia FEDER-) e um ERC avançado grant (741888 – CSI-diversão).
Queremos agradecer a Liliana Fajardo Mellor (Genes, desenvolvimento e doença; National Cancer Research Center) para uma leitura crítica do manuscrito.
Equipment | |||
B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
Heating pad | multiple suppliers | ||
Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
Microscope | Leica | different models have been used | |
Reagents | |||
1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
Antisedan | obtained from the animal facility | ||
Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
Midazolam | obtained from the animal facility | ||
100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
Eye ointment | Takeda | 7242 | |
Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |