ウイルスの遺伝子改変マウスの前立腺に CRISPR ガイドの配信
Summary
このプロトコルでは、マウスの前立腺へのウイルスの配信の新しく設立されたメソッドについて説明します。CRISPR/Cas9 の技術、遺伝子の過剰発現、Cre リコンビナーゼ配信のいずれかを使用して、技術は同所性同種遺伝子発現の変化をことができ、前立腺癌新規マウスモデルを実装します。
Abstract
前立腺がんの増加率と腫瘍の新しいドライバーまたは変調器の識別は重要です。前立腺癌の遺伝子組み換えマウス モデル (ジェム) は、腫瘍の不均一性とその複雑な進化ダイナミクスによって妨げています。従来の前立腺癌マウス モデルは、他の中で、生殖、条件付きノックアウト、トランスジェニック発現遺伝子、および異種移植モデル。これらのモデルのde novoの突然変異の生成は、複雑な時間のかかる、高価です。さらに、ひと前立腺癌細胞の小さなサブセットだけで孤立したイベントとして進化を知られているに対し、従来のモデルのほとんどは前立腺の上皮の大半を目標します。貴重なモデルでは、前立腺癌の開始だけでなく、高度な病気への進行をシミュレートする必要があります。
ここでウイルス粒子によって伝達細胞によって前立腺上皮で少数の細胞をターゲットにする方法をについて説明します。マウスの前立腺への組み換えウイルスの配信は、前立腺の上皮細胞での遺伝子発現の変化をことができます。ウイルスの型と量癌の開始の少数の細胞と遺伝子治療のため多くの細胞の伝達によって遺伝子の変化のための標的細胞の数を定義いたします。前葉、尿トラックから遠位部の手術に基づく注射を通してこのモデルで腫瘍を動物の尿の機能を損なうことがなく展開できます。また、前立腺上皮細胞のサブセットのみをターゲットに技術は腫瘍の栄養系拡張を有効、したがって基底膜を侵略と同様、人間の腫瘍の発生、進行を模倣します。
この手法は、生理学的な関連性の向上と強力な前立腺癌モデルを提供します。動物の苦しみは限られていると、追加の繁殖が不要なため、全体的に個体数が減少します。同時に新しい候補者の遺伝子の経路解析は加速され、効率的なより多くの費用があります。
Introduction
最後の 10 年間で、前立腺癌の発見・治療が大幅に向上します。それでも、平均寿命以下、前立腺癌の発生が増えています。症例、推定 110 万新しい世界、男性1の癌関連死の最も一般的な原因の中でです。前立腺癌は、その開発に遅いですが、予後は限られた治療の選択肢のため貧乏癌は、高度な転移状態に進んでいると。これまでに少数の遺伝子だけは、このがんの一般的なドライバーとして識別されているし、不均質性と multifocality バイオ マーカーと対象疾患ドライバー2,3の検出を阻害します。
生成 GEMMs の古典的な手法にはしばしば複雑さ、タイムリーな費用、コスト、障害します。条件付きノックアウト モデルは、胚性致死4生殖細胞で不活性化するときに発生する前立腺がんの候補者の遺伝子の研究に広く使用されています。最も一般的なモデルは、変更された Probasin5のいずれかによって駆動される前立腺特異 Cre リコンビナーゼまたは追加の交配によって、ジェム、統合されて PSA6プロモーターを含みます。これらのモデルでは興味の遺伝子は動物の尿路機能7を損なう可能性があります全体の臓器で増殖を生成する前立腺の上皮細胞の大半で対象となります。
マウス前立腺の前葉注入による Cre タンパク質のウイルスの伝達は、のみいくつかのセル8をターゲットにこの問題を解決できます。研究所の技術的な前提条件、専門知識、および目標を考慮に入れるの可能なバリエーションの広い範囲からメソッドの利点。アデノ ウイルスJunBとPten9やレンチ ウイルスPtenおよびTrp5310のターゲットをターゲットを活用した成功のアプローチは、他の中で示されています。ウイルスの構造または、ジェムなど、ルシフェラーゼの遺伝子を追加することが生物発光イメージング11を介して病気の進行の非侵襲的モニタリングとさらに有効にします。
ゲノム編集 CRISPR/Cas9 技術に基づく体ノックアウト12の急速な生成によってがんを研究する新たな機会を明らかにします。マウス前立腺の前葉にシングル ガイド Rna (sgRNAs) のウイルスの伝達は、前立腺癌のより関連する生理学的モデルを確立します。これにより、選択した突然変異を運ぶ単一のセルは膨張・侵略のことができるクローンを形成できます。さらに、複数のターゲット遺伝子の Rna ガイドの使用異なった遺伝子の変化と細胞クローンが生成されます。これは、癌の進行は、各遺伝子の改変や優性メカニズムの重要性を明らかにすることができますに腫瘍の不均一性と自然淘汰の圧力が許可されます。
遺伝子発現の変化のマウスの前立腺にウイルス粒子を配布する方法をご紹介します。小さな腹部切開によるマウスの前立腺前葉は公開され、葉にウイルス粒子を注入します。前立腺がんは 8 週間後から分析できるし、5 日間手術後、外科用クリップを皮膚から削除できます。全体的にみて、これはマウスにほとんど影響を持ってより大きい腫瘍マウスを損なうことがなく開発することができます迅速かつコスト効率の高いプロシージャです。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルでは前立腺癌 (図 2) のための強力な新しいマウス モデルを作成するウイルス注入によるマウス前立腺の前葉に遺伝子発現を変更する方法を説明します。アデノ ウイルスの成功の管理最初、2005年8: leow/らによって記述されていた。我々 は以前に Cre リコンビナーゼ蛋白質のアデノ ウイルス コーディングによって組織固有の削除<su…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
氏は、デンマークの癌学会 (R146-A9394-16-S2) から奨学金によって賄われていた。MFB と MKT AUFF ノヴァ (AUFF-E-2015-FLS-9-8) によって資金を供給されました。氏と MFB 共同大学院, 健康, AU によって資金を供給されました。E.F.W. 研究所は、経済 (SAF2015 70857、共同 ERDF EU によって資金を供給) と、ERC の助成 (741888 – CSI 楽しい) を高度なスペイン語省からの補助金によってサポートされます。
リリアナ ファハルド メラー (遺伝子、開発と病気に感謝したいです。国立がん研究センター) 原稿の重要な読書のため。
Materials
| Equipment | |||
| B6J.129(B6N)-Gt(ROSA)26Sortm1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J mice | The Jackson Laboratory | 26175 | |
| 0,5 ml U-100 insulin syringe | BD | 324825 | for virus injection |
| 1 ml syringe | BD | 300013 | for anesthesia injection |
| 30 G 1/2'' needle | BD | 304000 | for anesthesia injection |
| 6-0 Polysorb Suture | Medtronic | GL889 | to close the peritoneum |
| Disposable sterilized surgery drape | multiple suppliers | ||
| Heating pad | multiple suppliers | ||
| Povidone-Iodine Prep Pad | Fisher Scientific | 06-669-70 | |
| Trimming machine | Aesculap | GT415 | to shave the abdomen |
| Dumont Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Halsey Micro Needle Holder | F.S.T | 12500-12 | |
| Iris Scissors | F.S.T | 14094-11 | |
| Narrow Pattern Forceps | F.S.T | 11002-12 | |
| Ring Forceps | F.S.T | 11106-09 | |
| Wound Clip System Handle incl. Clips | F.S.T | 12030-01 | to close the skin |
| Wound Clip System Remover | F.S.T | 12030-04 | |
| Microscope | Leica | different models have been used | |
| Reagents | |||
| 1x PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Antisedan | obtained from the animal facility | ||
| Butorphanol | obtained from the animal facility | ||
| Medetomidinhydrochlorid | obtained from the animal facility | ||
| Midazolam | obtained from the animal facility | ||
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 22-032-103 | |
| Eye ointment | Takeda | 7242 | |
| Virus (AAV, AV) | multiple suppliers | virus used in this protocol is an in-house production | |
| pAKT antibody | CST | 4060 | used 1:200 dillution |
| GFP anitbody | CST | 2956 | used 1:100 dillution |
Riferimenti
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