성인 제 브라에서 독 소 루비 유발 심근 모델

Summary

성인 zebrafish (Danio rerio)에서 독 소 루비 유발 심근 모델을 생성 하는 메서드는 여기에 설명 되어 있습니다. 복 주입의 2 개의 다른 방법을 제시 하 고 다른 실험적인 그룹 사이 변이 줄이기 위해 조건을 설명.

Abstract

유전자 액세스할 수 성인 제 브라 (Danio rerio) 점점 척추 모델 심근과 같은 인간의 질병을 이해 하기 위한를 사용 했다. 편의 및 높은 처리량 유전자 조작에 순종 획득된 심근 모델의 세대 성인 zebrafish, 독 소 루비 유도 심장 근육 병 증 (DIC) 모델 등은 문을 열고 새로운 연구도로에 앞으로 유전자 검사를 통해 심근 한정자를 발견 포함 하 여. 다른 배아 zebrafish DIC 모델, 초기 급성 및 만성 단계 후 심근의 무대-종속 신호 메커니즘 및 치료 전략의 연구를 활성화 성인 zebrafish DIC 모델에서 확인할 수 있습니다. 그러나, 경험 있는 수 사관의 손 에서도 현재 모델 변수 결과 얻을 수 있습니다. DIC 모델의 미래 구현을 촉진 하기 위하여 성인 zebrafish이 DIC 모델을 생성 하 고 복 (IP) 주입의 두 가지 대체 방법을 설명 하는 방법에 자세한 프로토콜을 선물이. 우리는 더 신뢰할 수 있는 결과 얻을 결과 적절 하 게 해석 하는 방법에 제안을 제공 하는 유사에 옵션을 논의.

Introduction

독 소 루비 (DOX), Adriamycin, 라는 1960 년대^1,2이후는 항 종양 약 약물으로 개발 되었습니다. 그것은 지금 아직도 적극적으로 광범위 한 종양에 대 한 중요 한 화학요법 약물으로 사용. 그러나, DOX의 임상 응용의 복용량 의존 독성에 의해 방해 되었다, 특히 cardiotoxicity asymptomatic electrocardiographic 변경에서 pericarditis에 배열 하는 가변 증상이 특징 및 decompensated 심장 근육 병 증 ^{1 , 2}. 현재까지, 적어도 3 개의 주요 가설 일어났습니다 DIC, 활성화 된 반응성 산소 종 (선생님)^1,3,,45, topoisomerase II-β (의 억제를 포함 하 여 설명 하 TOP2β)^6,7, 그리고 세포내 칼슘의 릴리스^1,,89. 또한 DIC^10,11,,1213대 중요 위험 요인으로 유전적 제안 증거를 축적. 그러나 이러한 DIC 선천적인 유전자 정체성 관련, 크게 알려지지 않은 남아 있다. Dexrazoxane 유일한 보조 에이전트는 하지만 제한 된 구현^14,,1516, DIC, 치료 하는 미국 식품 및 의약품 안전 청 (FDA)에 의해 승인 추가 확인 하는 필요를 강조 치료 전략입니다. DIC의 동물 모델 따라서 이러한 목적에 대 한 탐구 된다. 때문에 그들의 접근 및 단순, DIC 모델에 기계 연구 수 잠재적으로 영향을 미칠 광범위 한 cardiomyopathies의 다른 종류에: 일반적인 병 인 수 들 간에 공유 될 다른 etiologies의 cardiomyopathies에서 특히 나중 병 적인 단계^17,18,,1920.

DIC의 설치류 모델, 뿐만 아니라 더 높은 처리량을 가진 zebrafish DIC 모델 새로운 유전적 요인 및 치료의 발견을 촉진 하기 위하여 개발 되었습니다. 배아 DIC 모델 치료 화합물²¹심사 투명 zebrafish 태아에 설립 되었습니다. 감안할 때 그는 cardiomyopathies는 진보적인 병을 가진 성인 개시 질병, 성인 zebrafish 심근 모델 되었습니다^{22,,2324,,2526}개발. 만성 빈 혈²⁴, DIC 성인 zebrafish²³의 두 번째 인수 심근 모델 뒤에서 발생 하는 심근에 대 한 첫 번째 인수 모델을 생성 되었습니다. 우리는 성인 zebrafish에 DOX의 단일 bolus 주사 뒤 심장 근육 병 증의 만성 단계 6 개월 후 주입 약 1 주 후 주입 (wpi), 이내 급성 단계 구성 된 cardiotoxicity 유도 발견. Rapamycin의 기계적 대상의 haploinsufficiency 동안(mtor) 심근을 살펴볼 만성 단계에서 그것은 과장 물고기 사망률 급성 단계에 단계-종속 분별을 성인 DIC 모델의 가치를 강조 메커니즘²³. 우리 성인 DIC 모델 스트레스 zebrafish insertional 심장 (ZIC) 돌연변이의²⁷insertional mutagenesis transposon 기반 접근 통해 생성 되는 컬렉션을 사용할 수 있습니다 입증 되었습니다. 3 알려진된 심근 유전자로 DnaJ (Hsp40) 체, 인도의 B, 및 회원 6b 파일럿 화면 확인 (dnajb6b) 새로운 DIC 민감성 유전자²⁸. 따라서, zebrafish에 성인 DIC 모델의 세대 주도 체계적으로 보완 기존 게놈 넓은 협회 연구 결과 (GWAS) 및 양이 많은 특색 소재 시 (QTL DIC에 대 한 유전 한정자의 식별을 가능 하 게 하는 새로운 방법론 ) 분석.

생성 및 성인 zebrafish DIC 모델의 구현 동안 우리는 다른 연구자 들 사이 또는 다른 주사 같은 조사에 의해 수행 중 에서도 상당한 변화 것으로 나타났습니다. 모델의 경도 특성 도전 다른 조사에서 결과 등록 하 고 순차 문제 해결 과정을 부과 한다. 이 간단한 심근 유도 스트레스 방법의 연구 공동체에 의해 사용을 촉진, 하 우리 자세히, 현재 두 가지 유형의 IP 주입, 우리의 프로토콜을 설명 하 고 다른 연구자 들 사이 유사를 줄이기 위해 고려 사항에 대해.

Protocol

여기에서 설명한 모든 절차 관리 및 실험 동물 사용 (국가 아카데미 압박. 2011), 대 한 가이드에 따라 수행 했다 그리고 그들은 메이 요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다. 1. 성인 Zebrafish 준비 얻으려면 적어도 두 배나 많은 DOX 주입에 필요한 총 물고기 탱크를 건너에 충분 한 번 식 쌍을 설정 합니다. 서로 다른 유전적 배경 가진 물고기를 비교 하?…

Representative Results

여기, 성인 zebrafish 모델 DIC에 IP 삽입을 수행 하는 두 가지 방법이 제공 됩니다. 고전, 설립 IP 주입 방법29를 사용 하 여, 하는 동안 그것은 주사 된 DOX 솔루션 (빨간색) 바늘 관통 하는 위치에서 밖으로 가끔 진흙 수 지적 했다. 대체 IP 주입은 복 막에서 3-4 m m는 DOX 출시 하는 바늘 침투에 대 한 다른 위치를 사용 하 여 (그림 1A)는 효과?…

Discussion

진보적인 DIC 모델, DOX 20 mg/kg의 복용량은 물고기 죽음에 1 wpi 하지만 여전히 결과 중 중요 한 물고기 죽음 및 4 wpi (그림 3 및 후 심장 기능의 감소를 발생 하지 않는 가장 높은 복용량으로 실험적으로 결정 그림 4C). 이 복용량은 설치류 DIC 모델 (15-25 mg/kg)에서 자주 사용 되 고 인간 (550 m g/m²는 15 mg/kg에 해당)에 누적 복용량을^4,…

Materials

Crossing tank	Aquaneering	ZHCT100	Fish breeding
Incubator	ThermoFisher		Maintaining embryo
3 L medium tank	Aquaneering	ZT280	Maintaining fish
Paramecia	Carolina	131560	Food for juvenile fish
Live hatched brine shrimp	in house		Food for adult fish
Doxorubicin hydrochloride	Sigma	D1515-10MG
1.5 ml safe-lock tube	Eppendorf	No. 022363204	For drug storage
Aluminum foil paper	Fisher	1213104	For preventing light exposure
Proteinase K	Roche	No. 03115887001	For dechorionating embryo
Hank's balanced salt solution (HBBS)	ThermoFisher	14025076	Vehicle for DOX
100 mm petri dish	Falcon	431741
10 μL NanoFil micro-syringe	WPI	NANOFIL	For injection
34 gauge needle	WPI	NF34BV-2	For injection
Tricaine	Argent	MS-222	Anesthetizing fish
96 well plate	Costar	3539	For embryo drug treatment
Transfer pipette	Bel-art product	F37898	For transfering embryo