Un modelo de cardiomiopatía inducida por la doxorrubicina en pez cebra adulto
Summary
Aquí se describe un método para generar un modelo de cardiomiopatía inducida por la doxorrubicina en adultos pez cebra (Danio rerio). Dos formas alternativas de la inyección intraperitoneal se presentan y se discuten las condiciones para reducir las variaciones entre los diferentes grupos experimentales.
Abstract
El pez cebra adulto genéticamente accesible (Danio rerio) se ha utilizado cada vez más como un modelo vertebrado para la comprensión de enfermedades humanas como la cardiomiopatía. Debido a su conveniencia y receptividad a la manipulación genética de alto rendimiento, la generación de modelos de cardiomiopatía adquirida, tales como el modelo de miocardiopatía inducida por la doxorrubicina (DIC) en pez cebra adulto, está abriendo las puertas a nuevas vías de investigación, como descubrir modificadores de cardiomiopatía por cribado genético hacia adelante. A diferencia del modelo de embrión de pez cebra DIC, inicial aguda y posteriormente crónica fases de miocardiopatía pueden determinarse en el modelo de pez cebra adulto DIC, lo que permite el estudio de mecanismos de señalización dependiente del escenario y estrategias terapéuticas. Sin embargo, pueden obtenerse resultados variables con el modelo actual, incluso en manos de investigadores experimentados. Para facilitar la futura implementación del modelo de Cid, se presenta un protocolo detallado sobre cómo generar este modelo DIC en pez cebra adulto y describir dos formas alternativas de inyección intraperitoneal (IP). Discutimos más opciones reducir las variaciones para obtener resultados fiables y ofrecen sugerencias sobre cómo interpretar correctamente los resultados.
Introduction
Doxorrubicina (DOX), también llamada Adriamycin, ha sido desarrollada como un medicamento antineoplásico desde la década de 19601,2. Ahora es todavía activamente usado como un medicamento quimioterapéutico importante para un amplio espectro de tumores. Sin embargo, aplicación clínica de DOX se vio obstaculizada por su toxicidad dependiente de la dosis, especialmente cardiotoxicidad caracterizada por síntomas variables que van desde cambios electrocardiográficos asintomáticos a pericarditis y descompensada la miocardiopatía 1 , 2. hasta la fecha, por lo menos tres hipótesis principales se han planteado para explicar la DIC, incluyendo activadas de oxígeno reactivo (ROS) las especies1,3,4,5, inhibición de la topoisomerasa II-β ( TOP2β)6,7y modulación del calcio intracelular de liberación de8,1,9. La acumulación de pruebas también sugiere predisposición genética como factor de riesgo fundamental para DIC10,11,12,13. Identidades de genes relacionados con estas predisposiciones DIC, sin embargo, siguen siendo en gran parte desconocidos. El dexrazoxano es el único agente adyuvante aprobado por la US Food y Drug Administration (FDA) para tratar Cid, pero con limitada aplicación14,15,16, subrayando la necesidad de identificar más estrategias terapéuticas. Modelos animales de DIC se exploran, por tanto, para estos fines. Debido a su accesibilidad y sencillez, estudios mecanísticos de modelos DIC potencialmente podrían tener impactos más amplios en otros tipos de miocardiopatías: patogenesia común podría ser compartido entre miocardiopatías de diversas etiologías, especialmente en más adelante las etapas patológicas17,18,19,20.
Además de modelos de roedores de la Cid, modelos DIC de pez cebra con un mayor rendimiento se han desarrollado para facilitar el descubrimiento de nuevos factores genéticos y terapéuticos. Se ha establecido un modelo embrionario de DIC en los embriones de pez cebra transparente para la detección de compuestos terapéuticos21. Dado que las miocardiopatías son enfermedades de inicio adulto con una patogenesia progresiva, cardiomiopatía del pez cebra adulto modelos han sido desarrollados22,23,24,25,26. Generamos el primer modelo adquirido para la cardiomiopatía resultante de la anemia crónica24, seguido por el Cid como el segundo modelo de cardiomiopatía adquirida en pez cebra adulto23. Hemos encontrado que la inyección de un bolo único de DOX en pez cebra adulto induce la cardiotoxicidad que consiste en una fase aguda más o menos dentro de 1 semana posterior a la inyección (wpi), seguida por una fase crónica de la cardiomiopatía para después de la inyección 6 meses. Mientras que el haploinsufficiency de la mecanicista Diana de la rapamicina(mtor) mejora la cardiomiopatía en la fase crónica, exagera la mortalidad de peces en la fase aguda, subrayando el valor del modelo DIC adulto discernir dependiente de la etapa mecanismos23. Hemos demostrado además que el modelo adulto de DIC puede utilizarse para destacar una colección de pez cebra insertional cardiaca (ZIC) mutantes que se están generando a través de un enfoque basado en el transposon mutagénesis de insertional del27. Una pantalla piloto identificado 3 genes cardiomiopatía conocido como DnaJ (Hsp40) homólogo, subfamilia B y miembro 6b (dnajb6b) como nuevo DIC susceptibilidad genes28. Por lo tanto, la generación del modelo adulto de DIC en el pez cebra condujo a una nueva metodología que permite sistemáticamente identificación de modificadores genéticos de la DIC, que complementa la existente estudio de asociación del genoma completo (GWAS) y locus de carácter cuantitativo (QTL ) análisis.
Durante la generación y aplicación del modelo DIC pez cebra adulto, hemos observado variaciones significativas entre los diferentes investigadores o incluso entre diferentes inyecciones realizadas por el investigador mismo. La naturaleza longitudinal del modelo impone retos para registrar los resultados de diferentes investigadores y al proceso secuencial de solución de problemas. Para facilitar el uso de este sencillo método de estrés inducen cardiomiopatía por la comunidad de investigación, describimos nuestro protocolo en detalle, presente dos tipos de inyección de la IP y discutir consideraciones para reducir las variaciones entre los diferentes investigadores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para modelar un DIC progresiva, la dosis de 20 mg/kg DOX se determinó experimentalmente como la dosis más alta que no causa muerte de peces importantes durante 1 wpi pero aún resultados en la muerte de peces y la reducción de la función cardiaca después de wpi 4 (figura 3 y Figura 4). Esta dosis es comparable a los que se utilizan con frecuencia en modelos de roedores DIC (15-25 mg/kg) y la dosis acumulativa de límite en los seres humanos (550 mg/m2…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado en parte por una subvención de desarrollo científico de la Asociación Americana del corazón (14SDG18160021 a YD), la US NIH R01 otorga HL 81753 y HL 107304 al XX y la Fundación de Mayo para XX.
Materials
| Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
| Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
| 3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
| Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
| Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
| Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
| 1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
| Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
| Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
| Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
| 100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
| 10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
| 34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
| Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
| 96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
| Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |
Riferimenti
- Octavia, Y., et al. Doxorubicin-induced cardiomyopathy: from molecular mechanisms to therapeutic strategies. J Mol Cell Cardiol. 52 (6), 1213-1225 (2012).
- Singal, P. K., Iliskovic, N. Doxorubicin-induced cardiomyopathy. N Engl J Med. 339 (13), 900-905 (1998).
- Angsutararux, P., Luanpitpong, S., Issaragrisil, S. Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity: Overview of the Roles of Oxidative Stress. Oxid Med Cell Longev. , 795602 (2015).
- Ichikawa, Y., et al. Cardiotoxicity of doxorubicin is mediated through mitochondrial iron accumulation. J Clin Invest. 124 (2), 617-630 (2014).
- Zhang, Y. W., Shi, J., Li, Y. J., Wei, L. Cardiomyocyte death in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 57 (6), 435-445 (2009).
- Sawyer, D. B. Anthracyclines and heart failure. N Engl J Med. 368 (12), 1154-1156 (2013).
- Zhang, S., et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 18 (11), 1639-1642 (2012).
- Dodd, D. A., et al. Doxorubicin cardiomyopathy is associated with a decrease in calcium release channel of the sarcoplasmic reticulum in a chronic rabbit model. J Clin Invest. 91 (4), 1697-1705 (1993).
- Mitry, M. A., Edwards, J. G. Doxorubicin induced heart failure: Phenotype and molecular mechanisms. Int J Cardiol Heart Vasc. 10, 17-24 (2016).
- Aminkeng, F., et al. A coding variant in RARG confers susceptibility to anthracycline-induced cardiotoxicity in childhood cancer. Nat Genet. 47 (9), 1079-1084 (2015).
- Deng, S., et al. Dystrophin-deficiency increases the susceptibility to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Eur J Heart Fail. 9 (10), 986-994 (2007).
- Leong, S. L., Chaiyakunapruk, N., Lee, S. W. Candidate Gene Association Studies of Anthracycline-induced Cardiotoxicity: A Systematic Review and Meta-analysis. Sci Rep. 7 (1), 39 (2017).
- Wasielewski, M., et al. Potential genetic predisposition for anthracycline-associated cardiomyopathy in families with dilated cardiomyopathy. Open Heart. 1 (1), e000116 (2014).
- Lebrecht, D., et al. Dexrazoxane prevents doxorubicin-induced long-term cardiotoxicity and protects myocardial mitochondria from genetic and functional lesions in rats. Br J Pharmacol. 151 (6), 771-778 (2007).
- QuanJun, Y., et al. Protective Effects of Dexrazoxane against Doxorubicin-Induced Cardiotoxicity: A Metabolomic Study. PLoS One. 12 (1), e0169567 (2017).
- Seifert, C. F., Nesser, M. E., Thompson, D. F. Dexrazoxane in the prevention of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Ann Pharmacother. 28 (9), 1063-1072 (1994).
- Adams, J. W., et al. Enhanced Galphaq signaling: a common pathway mediates cardiac hypertrophy and apoptotic heart failure. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (17), 10140-10145 (1998).
- Bowles, N. E., Bowles, K. R., Towbin, J. A. The "final common pathway" hypothesis and inherited cardiovascular disease. The role of cytoskeletal proteins in dilated cardiomyopathy. Herz. 25 (3), 168-175 (2000).
- Kroumpouzou, E., et al. Common pathways for primary hypertrophic and dilated cardiomyopathy. Hybrid Hybridomics. 22 (1), 41-45 (2003).
- Towbin, J. A., Bowles, K. R., Bowles, N. E. Etiologies of cardiomyopathy and heart failure. Nat Med. 5 (3), 266-267 (1999).
- Liu, Y., et al. Visnagin protects against doxorubicin-induced cardiomyopathy through modulation of mitochondrial malate dehydrogenase. Sci Transl Med. 6 (266), 266ra170 (2014).
- Asimaki, A., et al. Identification of a new modulator of the intercalated disc in a zebrafish model of arrhythmogenic cardiomyopathy. Sci Transl Med. 6 (240), 240ra274 (2014).
- Ding, Y., et al. Haploinsufficiency of target of rapamycin attenuates cardiomyopathies in adult zebrafish. Circ Res. 109 (6), 658-669 (2011).
- Sun, X., et al. Cardiac hypertrophy involves both myocyte hypertrophy and hyperplasia in anemic zebrafish. PLoS One. 4 (8), e6596 (2009).
- Sun, Y., et al. Activation of the Nkx2.5-Calr-p53 signaling pathway by hyperglycemia induces cardiac remodeling and dysfunction in adult zebrafish. Dis Model Mech. 10 (10), 1217-1227 (2017).
- Yang, J., Shah, S., Olson, T. M., Xu, X. Modeling GATAD1-Associated Dilated Cardiomyopathy in Adult Zebrafish. J Cardiovasc Dev Dis. 3 (1), (2016).
- Ding, Y., et al. Trapping cardiac recessive mutants via expression-based insertional mutagenesis screening. Circ Res. 112 (4), 606-617 (2013).
- Ding, Y., et al. A modifier screen identifies DNAJB6 as a cardiomyopathy susceptibility gene. JCI Insight. 2 (8), (2017).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal injection into adult zebrafish. J Vis Exp. (42), (2010).
- Wang, L. W., et al. Standardized echocardiographic assessment of cardiac function in normal adult zebrafish and heart disease models. Dis Model Mech. 10 (1), 63-76 (2017).
- Desai, V. G., et al. Development of doxorubicin-induced chronic cardiotoxicity in the B6C3F1 mouse model. Toxicol Appl Pharmacol. 266 (1), 109-121 (2013).
- Zhu, W., Shou, W., Payne, R. M., Caldwell, R., Field, L. J. A mouse model for juvenile doxorubicin-induced cardiac dysfunction. Pediatr Res. 64 (5), 488-494 (2008).
- Chatterjee, K., Zhang, J., Honbo, N., Karliner, J. S. Doxorubicin cardiomyopathy. Cardiology. 115 (2), 155-162 (2010).
- Bang, C., et al. Cardiac fibroblast-derived microRNA passenger strand-enriched exosomes mediate cardiomyocyte hypertrophy. J Clin Invest. 124 (5), 2136-2146 (2014).
- Rassaf, T., Kelm, M. Protection from diabetic cardiomyopathy – putative role of the retinoid receptor-mediated signaling. J Mol Cell Cardiol. 59, 179-180 (2013).
- Wahbi, K., et al. Dilated cardiomyopathy in patients with mutations in anoctamin 5. Int J Cardiol. 168 (1), 76-79 (2013).
- Zhou, M. D., Sucov, H. M., Evans, R. M., Chien, K. R. Retinoid-dependent pathways suppress myocardial cell hypertrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7391-7395 (1995).
- Hershman, D. L., et al. Doxorubicin, cardiac risk factors, and cardiac toxicity in elderly patients with diffuse B-cell non-Hodgkin’s lymphoma. J Clin Oncol. 26 (19), 3159-3165 (2008).
- Silber, J. H., Barber, G. Doxorubicin-induced cardiotoxicity. N Engl J Med. 333 (20), 1359-1360 (1995).
- Von Hoff, D. D., et al. Risk factors for doxorubicin-induced congestive heart failure. Ann Intern Med. 91 (5), 710-717 (1979).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J Vis Exp. (34), (2009).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A novel protocol for the oral administration of test chemicals to adult zebrafish. Zebrafish. 8 (4), 203-210 (2011).
- Collymore, C., Rasmussen, S., Tolwani, R. J. Gavaging adult zebrafish. J Vis Exp. (78), (2013).
