Здесь описан метод для создания модели доксорубицин индуцированной кардиомиопатия в взрослых рыбок данио (Danio рерио). Два альтернативных способа внутрибрюшинной инъекции представлены и обсуждаются условия уменьшить различия между различных экспериментальных групп.
Генетически доступной взрослых рыбок данио (Danio рерио) все шире используется как позвоночных модель для понимания человеческих заболеваний, таких как кардиомиопатии. Из-за его удобства и ответственностью для высокой пропускной способности генетических манипуляций поколения модели приобретенных кардиомиопатия, например доксорубицин индуцированной кардиомиопатия (DIC) модель в взрослых рыбок данио, открывает двери для новых исследований проспектов, в том числе открытие кардиомиопатия модификаторы через вперед генетический скрининг. Отличается от модели DIC эмбриональных данио рерио, первоначальный острый и позднее хронической фазы кардиомиопатия может определяться в модели DIC взрослых рыбок данио, позволяя изучения сигнальных механизмов зависят от стадии и терапевтических стратегий. Однако переменная результаты могут быть получены с текущей моделью, даже в руках опытных следователей. Для облегчения будущей реализации модели DIC, мы представляем подробный протокол о том, как создавать эту модель ДВС в взрослых рыбок данио и описать два альтернативных способа внутрибрюшинной инъекции (IP). Мы далее обсудить варианты о том, как уменьшить вариации для получения надежных результатов и представить предложения о том, как надлежащим образом интерпретировать результаты.
Доксорубицин (DOX), также названный адриамицин, был разработан как Антинеопластические препарат начиная с 1960-х1,2. Это сейчас все еще активно используется как важный химиотерапевтический препарат для широкого спектра опухоли. Однако клиническое применение DOX затрудняется его дозозависимый токсичность, особенно кардиотоксичности характеризуется переменной симптомы, начиная от бессимптомного электрокардиографических изменений перикардита и декомпенсированной кардиомиопатия 1 , 2. на сегодняшний день, по крайней мере три основных гипотезы были подняты объяснить DIC, включая активированные реактивнооксигенных видов (ров)1,3,4,5, ингибирование топоизомеразы II-β () 1,8,9выпуск TOP2β)6,7и модуляция внутриклеточного кальция. Накапливая доказательства также предлагает генетической предрасположенности, как ключевой фактор риска для ДВС10,11,12,13. Джин тождества, относящиеся к этим DIC предрасположенности, однако, остаются во многом неизвестным. Дексразоксан является только агентом адъювантной одобрено США продуктов питания и медикаментов (FDA) для лечения DIC, но с ограниченным осуществлением14,,1516, подчеркнув необходимость выявления дополнительных терапевтические стратегии. Поэтому Животные модели DIC изучаются для этих целей. Благодаря их доступности и простоты, механистических исследования на моделях DIC потенциально может иметь более широкие последствия на других типах кардиомиопатии: общий патогенез может распределяться среди кардиомиопатии различной этиологии, особенно на позднее патологических этапов17,18,19,20.
Помимо грызунов модели DIC данио рерио DIC модели с более высокой пропускной способности были разработаны для облегчения обнаружения новых генетических факторов и терапии. В прозрачной данио рерио эмбрионов для скрининга терапевтических соединений21была создана модель эмбриональных DIC. Учитывая, что кардиомиопатии являются заболевания onset взрослого с прогрессивной патогенеза, взрослых рыбок данио кардиомиопатия, модели были разработаны22,–23,–24,–25,–26. Мы создали первый приобретенных модель кардиомиопатия вследствие хронической анемии24, следуют DIC как вторая модель приобретенных кардиомиопатия в взрослых рыбок данио23. Мы обнаружили, что введения единого болюс DOX в взрослых рыбок данио индуцирует кардиотоксичность, состоящий из острой фазы примерно в течение 1 недели после инъекции (ИЗВ), а затем хроническая фаза кардиомиопатия 6 месяцев впрыск. Во время haploinsufficiency механистический цель rapamycin(mtor) улучшает кардиомиопатия в хронической фазе, он преувеличивает смертности рыб в острой фазе, подчеркнув значение Взрослый модели DIC различать этап зависимых механизмов23. Мы далее показал, что взрослый DIC модель может использоваться для подчеркнуть коллекцию данио рерио инсерционному сердца (ZIC) мутантов, которые создаются с помощью подхода на основе transposon инсерционному мутагенезу27. Экспериментальный экран определены 3 известных кардиомиопатия генов, а также DnaJ (Hsp40) гомолога, подсемейство B и член 6b (dnajb6b) как генов восприимчивости новый DIC28. Таким образом поколения взрослых DIC модели в zebrafish привели к новой методологии, которая систематически позволяет идентифицировать генетические модификаторов для ДВС, которая дополняет существующие исследования генома всей ассоциации (GWAS) и количественный признак локус (QTL ) анализа.
Во время генерации и реализации модели DIC взрослых рыбок данио мы заметили значительные различия среди различных исследователей и/или даже среди различных инъекций, выполняемых же следователь. Продольные характер модели налагает проблемы для регистрации результатов от разных исследователей и последовательный процесс устранения неполадок. Для облегчения использования этой простой кардиомиопатия вызывая стресс методом исследовательского сообщества, мы описать наш протокол в деталях, настоящее два вида IP инъекции и обсудить соображения для уменьшения различий между разными исследователями.
Для моделирования прогрессивного DIC, в дозе 20 мг/кг DOX определяли экспериментально, как самая высокая доза, которая не вызывает значительных рыбы смерть во время 1 wpi, но до сих пор результаты в смерти рыбы и сокращение сердечной функции после 4 ИЗВ (рис. 3 и Рисун…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа частично поддержали ученый развития грант от Американской ассоциации сердца (14SDG18160021 м), R01 низ США предоставляет HL 81753 и 107304 HL-XX и Фонд Майо-XX.
Crossing tank | Aquaneering | ZHCT100 | Fish breeding |
Incubator | ThermoFisher | Maintaining embryo | |
3 L medium tank | Aquaneering | ZT280 | Maintaining fish |
Paramecia | Carolina | 131560 | Food for juvenile fish |
Live hatched brine shrimp | in house | Food for adult fish | |
Doxorubicin hydrochloride | Sigma | D1515-10MG | |
1.5 ml safe-lock tube | Eppendorf | No. 022363204 | For drug storage |
Aluminum foil paper | Fisher | 1213104 | For preventing light exposure |
Proteinase K | Roche | No. 03115887001 | For dechorionating embryo |
Hank's balanced salt solution (HBBS) | ThermoFisher | 14025076 | Vehicle for DOX |
100 mm petri dish | Falcon | 431741 | |
10 μL NanoFil micro-syringe | WPI | NANOFIL | For injection |
34 gauge needle | WPI | NF34BV-2 | For injection |
Tricaine | Argent | MS-222 | Anesthetizing fish |
96 well plate | Costar | 3539 | For embryo drug treatment |
Transfer pipette | Bel-art product | F37898 | For transfering embryo |