Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll, histologische und molekulare Analyse von Hautproben nach Candida Albicans intradermale Injektion ermöglicht. Dieses Protokoll hält die strukturelle Integrität der Haut und erlaubt die Lokalisierung von Gewebe-Resident oder neu rekrutierten Immunzellen sowie die Verteilung der Erreger.
Abstract
Die Haut ist ein extrem erweiterten Organ des Körpers, und durch diese große Oberfläche ist es kontinuierlich Mikroorganismen ausgesetzt. Hautschäden kann leicht zu Infektionen in der Dermis führen, was wiederum bei der Verbreitung von Krankheitserregern in die Blutbahn führen kann. Verstehen, wie das Immunsystem bekämpft Infektionen im sehr frühen Stadium und wie der Host die Erreger beseitigen kann, ist ein wichtiger Schritt um die Basis für zukünftige therapeutische Interventionen gesetzt. Hier beschreiben wir ein Modell der Candida Albicans -Infektion, die die Prozesse zu, die früh während einer Infektion visualisieren, auch wenn der Erreger ist die epitheliale Barriere sowie die Immunantwort ausgelöst durch die C. Albicans vergangen auftreten Invasion. Diese Infektionsmodell verwendet, histologische Analysen durchzuführen, die die Immunzellen zu zeigen, die die Haut sowie die Präsenz und die Lokalisation des Erregers zu infiltrieren. Proben gesammelt, nachdem die Infektion für die RNA-Extraktion verarbeitet werden kann.
Introduction
Der menschliche Körper ist mit einer extrem hohen Anzahl von Mikroorganismen bedeckt. Die Hautoberfläche ist der Lebensraum von fast 1 Million Bakterien pro Quadratzentimeter1. Diese Zahl spiegelt jedoch nicht die ganze Vielfalt der Mikroorganismen, die die Haut kolonisiert. Neben Bakterien ist der menschliche Körper kolonisiert durch viele Pilzarten, darunter C. Albicans, die in der Lage, sowohl auf die Schleimhaut und die Haut Ebene2überleben.
Der Anteil der Menschen mit der Diagnose mit Pilzinfektionen sind in den letzten Jahren enorm gestiegen. Dies ist vor allem aufgrund der höheren Anzahl von immungeschwächten Personen, d. h., HIV-positiven Patienten und Patienten, die entweder durch Chemotherapie oder Immunsuppressiva nach Transplantation3gegangen. In einer Überwachung Studie in den Vereinigten Staaten zeigten Wisplinghoff Et Al. , dass 9,5 % der Blutbahn Nosokomialinfektionen durch Candida Spezies4verursacht wurden. Durch das vermehrte Auftreten von Pilzinfektionen und vor allem wegen der erhöhten Anteil der Candida -Spezies bei Infektionen der Blutbahn gefunden wird verstehen, wie diese Erreger die Steuerung des Immunsystems entkommt extrem wichtig.
C. Albicans ist ein dimorphen Pilz, der in verschiedenen morphologischen Formen wie Hefe, Blastospores, Pseudohyphae und Hyphen abhängig von den Umgebungsbedingungen5wächst. In seiner bodenaggregaten Form C. Albicans zeigt seine höchste Kapazität der Invasivität und hat die Fähigkeit, das Epithel6durchdringen.
C. Albicans Infektionen sind mit mehreren experimentellen Ansätzen untersucht worden. Das häufigste Modell der Infektion ist die intravenöse Injektion von C. Albicans Hefe7. Jedoch wird dieses Modell nicht alle Prozesse, die passieren berücksichtigt bevor der Pilz schafft es in die Blutbahn zu verbreiten. Ein weiteres Modell nutzt die Fähigkeit von C. Albicans , das Epithel einzudringen. Diese Methode, auch bekannt als das Schleifpapier Model8, wurde von Gaspari Et Al. 19989entwickelt und besteht aus die Haut, wodurch das Stratum Corneum vor dem Auftragen von C. AlbicansSchleifen mit Schleifpapier. Dieses Verfahren ermöglicht den Pilz, das Epithel, so dass die Analyse der invasiven Fähigkeiten des Erregers zu durchdringen. Zu guter Letzt wurden andere Modelle von Infektionen für die Magen-Darm-10 und Atemwege11 in verschiedenen Studien verwendet.
Die Bildung einer Wunde (wie im Sand Papiermodell) bewirkt die Aktivierung von mehreren wegen, einschließlich Immunzelle Rekrutierung und Aktivierung, um den heilenden Prozess-12zu fördern. Dies kann entweder ändern oder maskieren der Immunantwort, die speziell gegen den Erreger, wodurch verwirrende Ergebnisse ausgelöst.
Hier beschreiben wir eine Methode der Infektion der Haut, die ursprüngliche Wunde Bildung vermeidet und die Induktion einer basalen entzündlichen Umgebung. Um die intakte epitheliale Struktur beizubehalten, injizieren wir direkt C. Albicans in seiner bodenaggregaten Form in die Tiefe Derma. Obwohl eine einzelne Injektion leichte Entzündung hervorrufen kann, ist die Menge der Entzündung begrenzt und eingeschränkt im Vergleich zur Bildung einer offenen Wunde wie Schleifpapier-Modell. Der Ansatz, den wir hier beschreiben ermöglicht die Untersuchung der Immunantwort auf Pilzinfektion und Ausbreitung die übermäßige und bereits vorhandene entzündliche Umwelt durch mechanische Beschädigungen zu vermeiden.
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Protocol
Die Verfahren wurden alle unter den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt und unter der Aufsicht des Department of Animal Resources bei Kindern betrieben's Hospital (Bogen) am Krankenhaus Boston der Kinder oder wurden von den italienischen genehmigt Ministerium für Gesundheit und unter institutionellen Animal Care Committee der Universität Mailand-Bicocca durchgeführt.
1. C. Albicans Vorbereitung
- Kultur C. Albicans, Stamm CAF3-113, in Röhrchen mit reichen Medium (Hefe-Extrakt Pepton Traubenzucker (YEPD), 1 % (w/V) Hefeextrakt, 2 % (w/V) von Bacto Pepton, 2 % (w/V) Glukose) ergänzt mit Uridin (50 mg/L) bei 25 ° C. Unter diesen Bedingungen wächst C. Albicans als eine Hefe.
Hinweis: Andere C. Albicans -Stämme können verwendet werden, wie z. B. die klinische C. Albicans Stamm SC531413isolieren. Da wir vor kurzem gezeigt haben, dass die Colitis Prozess durch die Aktivierung des angeborenen Immunsystems14, theoretisch jede C. Albicans Belastung induziert wird, die ihre Zellwand-Komponenten und Struktur beibehält sowie die Fähigkeit, stammen von bodenaggregaten Projektionen genutzt werden. - Überwachen Sie die Kultur durch die zelluläre Konzentration mit einer Zelle Zähler Analyzer zählen.
- Ernten Sie die Kultur, wenn es eine Konzentration von etwa 8 x 106 Zellen/mL erreicht. Alternativ können Sie ein Spektralphotometer um OD600zu messen.
Hinweis: In der Regel einen Wert von OD600 = 1 entspricht einer Hefe-Konzentration von 3 x 107 Zellen/mL, Titration wird jedoch empfohlen. - Aufschwemmen der Kulturkreis in YEPD-Uridin Medium, mit HEPES (50 mM, pH 7,5) als ein Puffer-Agent und inkubieren Sie die Kultur bei 37 ° C, Hyphen Bildung zu induzieren. Überprüfen Sie bodenaggregaten Bildung unter dem Mikroskop bei 100 X Vergrößerung. Bodenaggregaten Formation ist sichtbar 5 h nach Kultivierung bei 37 ° C; jedoch verwenden Sie die Zellen 16 h nach der Inkubation bei 37 ° C erreicht der bodenaggregaten Anteil fast 95 % der gesamten Kultur.
- Um die Vorbereitung in bodenaggregaten Konzentration weiter zu bereichern, Zentrifuge Aliquote der Kultur bei 3.300 x g für 5 min. überstand verwerfen und das Pellet in sterilen PBS in einer Konzentration von 1 x 108 Hyphen/mL Aufschwemmen.
2. tief dermalen Injektion
- 24 h vor der Infektion-Verfahren, die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) zu betäuben und dann die Flanke der Mäuse mit einer elektrischen Haarschneidemaschine rasieren.
Hinweis: Nach jedem Eingriff mit Narkose, legen Sie die Mäuse unter einer Wärmelampe bis sie effizient erholt haben. - Ruhen Sie die Mäuse für 24 h, eine Entzündung durch die Rasur-Prozess zu vermeiden.
- 24 h nach dem Eingriff rasieren zu betäuben die Mäuse mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg).
- Überprüfen Sie die Pfote Reflex um sicherzustellen, dass die Mäuse tief betäubt sind. Beurteilen Sie die Pfote Reflex fest Kneifen die Pfote. Wenn die Narkose erreicht ist, wird das Tier keine Schmerzen empfinden und bewegt sich nicht.
- Spritzen Sie C. Albicans hyphen in die Tiefe Derma mit einer 0,3 mL Insulin Spritze mit einer Nadel 30 x 8 mm in einem Endvolumen von 50 µL/Injektion, entspricht 5 x 106 Hyphen/Injektion.
- Ziehen Sie die Haut der rasierte Flanke straff mit zwei Fingern um die Lautstärke direkt in die Tiefe Derma zu injizieren. Stechen Sie die Nadel mit einem Winkel von 10-15° mit der schräge der Nadel nach oben.
- Mit diesem Winkel wird der Erreger mit einer Tiefe von etwa 300-500 µm injiziert werden. Um sicherzustellen, dass die Injektion gut ausgeführt wird, überprüfen Sie, dass das injizierte Volumen bildet eine Beule, die ist wenige Minuten nach der Injektion absorbiert.
Hinweis: Die Beule gebildet nach die Injektion von ca. 1 cm2sein wird. Dies ist der Bereich, der zum festgelegten Zeitpunkt für Molekulare oder histologische Analyse entfernt wird. - Markieren Sie für Zeitpunkte von weniger als 24 Stunden (empfohlen) den Bereich der Infektion mit einem Marker, da die Beule gebildet mit der Injektion für ein paar Minuten bleibt nach dem es absorbiert wird. Für Zeitpunkte von 24 h oder mehr ist dieser Schritt nicht erforderlich, da ein Geschwür oder eine Zyste deutlich sichtbar ist.
3. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für histologische Färbung
- Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern.
- Chirurgische Pinzette verwenden, ziehen Sie die Haut an der Grenze des Standortes injiziert, zuvor mit dem Filzstift markiert. Mit Chirurgische Schere, Verbrauchsteuern der infizierten Webseite durch Schneiden der Haut nach der markierten Zeile.
Hinweis: Achten Sie darauf, die Haut von das Bauchfell mit Rundspitze Schere zu trennen. - Tauchen Sie die Haut in einer Einweg-base Form gefüllt mit optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung, mit der Innenseite der Haut nach oben. Einfrieren der Probenmaterials in flüssigem Stickstoff, bis die Masse weiß wird. Nicht lassen Sie den flüssigen Stickstoff die Probe zu decken, bevor es vollständig gefroren ist, da dies die Probe beschädigen würde.
Hinweis: Vorsicht! Während Schritt 3.3 tragen Sie einen Gesichtsschutz für Schutz von flüssigem Stickstoff. - Wenn die Proben nicht sofort für die Vorbereitung der Folie verwendet werden, speichern sie schnell bei-80 ° C.
Hinweis: Proben können bei-80 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
4. Vorbereitung der Folien
- Halbieren Sie die Probe vorzubereiten die Scheiben für Histologie, ausgehend von der Mitte der Probe.
- Schneiden Sie mit einem Kryostat 5 µm dicke Scheiben.
Hinweis: Für Hautproben, sollte die Temperatur des Kryostaten nicht höher als-25 ° c werden Eine höhere Temperatur würde dazu führen, ein partielles Schmelzen des H-OAT und daher die Proben nicht aufrechterhalten würden in der richtigen Position während der Schneidvorgang. - Verwenden Sie positiv geladene Objektträger, um die Scheiben zu sammeln.
- Wenn die gesammelten Scheiben nicht bald nach der Zubereitung verwendet werden, bewahren Sie sie bei-20 ° C. An dieser Stelle können die Scheiben bei-20 ° C auf unbestimmte Zeit gespeichert werden.
5. Hämatoxylin und Eosin Färbung
- Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin für 4 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.
- Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Eosin Y-Lösung für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min. Spülen die Folien mit destilliertem Wasser, bevor Sie fortfahren des Protokolls.
- Trocknen Sie durch Eintauchen in seriell steigenden Konzentrationen von Ethanol-Lösungen (50 %, 70 %, 80 %, 95 %, 100 % aus). Tauchen Sie die Folien für 15 s in jeder Ethanol-Lösung.
- Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.
- Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.
- Abrufen von Bildern von Dias mit einem Diascanner Mikroskop bei 40 X Vergrößerung.
6. Perjodsäure-Schiff (PAS) Färbung
- Befestigen Sie den Folien mit ≥99.5 % Aceton bei Raumtemperatur für 1 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 1 min.
- Färben Sie den Folien durch Eintauchen in Perjodsäure Lösung (1 g/dL) für 5 min. Waschen Folien in 3 Änderungen von destilliertem Wasser.
- Färben Sie den Folien durch Untertauchen im Schiff's Reagenz für 15 min. Waschen Folien in fließendem Leitungswasser für 5 min.
- Die Folien durch Eintauchen in Gills Hämatoxylin zu beflecken, für 5 min. Waschen Sie die Folien in fließendem Leitungswasser für 30 s.
- Entwässern Sie die Folien durch Eintauchen in 3 Änderungen von 100 % Ethanol. Tauchen Sie die Folien für 15 s jedes Mal.
- Deaktivieren Sie die Folien für mindestens 2 min durch Eintauchen in eine histologische Clearing Agent.
- Montieren Sie die Folien mit Eindeckmittel und Deckel rutscht.
- Abrufen von Bildern der Folien mit einem Mikroskop-Dia-Scanner.
7. Probieren Sie Sammlung und Aufbereitung für die RNA-Extraktion
- Die Mäuse nach institutionellen Verfahren einschläfern. Die Hautproben wie in Schritt 3.2 zu entfernen.
- Tauchen Sie die Proben in einem 2 mL Snap-Cap Röhrchen mit 1 mL Reagenz für saure Guanidinium-Thiocyanat-Phenol-Chloroform-Extraktion.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten und die Proben bei-80 ° c gelagert werden - Schneiden Sie die Probe in Stücke von ca. 0,2 cm2 mit chirurgischer Pinzette.
Hinweis: Vorsicht! Die meisten der Reagenzien zur RNA-Isolierung sind toxisch und mutagen. 7.3 und 7.4 Schritte müssen werden unter einem Abzug durchgeführt. - Die Probe mit einem Rührwerksmühle mit einer Geschwindigkeit von 20 Schwingungen/s für 20 min. Alternativ zu zerschlagen, mechanische Töpfer kann verwendet werden.
- Überprüfen Sie die effektive Homogenisierung der Proben durch einen Blick auf das Vorhandensein von intakten Teile der Haut. Wiederholen Sie diesen Schritt, wenn die Proben nicht vollständig homogenisiert werden.
- Zentrifugieren Sie die Proben bei 16.000 x g für 1 min. halten die Überstände für RNA-Extraktion und entsorgen Sie die Tablette. Dieser Schritt wird durchgeführt, um zu beseitigen, Haare und Schmutz, die die extraktionskolonnen blockieren könnten.
- Gehen Sie mit RNA-Extraktion mittels RNA Reinigung Spalten14.
- Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um RNA-Reinigung und Konzentration zu beurteilen. Wenn RNA Extrakte für die cDNA-Vorbereitung nicht sofort verwendet werden, speichern Sie die Proben bei-80 ° C.
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Representative Results
Durch die Injektion des Krankheitserregers direkt in die Tiefe Derma bleibt die strukturelle Morphologie des Gewebes intakt (Abbildung 1A).
Die Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität der Haut ermöglicht die Erkennung von Immunzellen und ihre Lokalisation am Ort der Infektion. Die höhere Vergrößerung dargestellt in Abbildung 1 b zeigt, dass der Abszess ist vor allem der Polymorphkernige Leukozyten (PMCs), die die Ausbreitung des Erregers enthalten durch seine Beschränkung auf der Website der Infektion zusammen. Rekrutierung von PMCs, z. B. Neutrophile, ermöglicht die Bildung von den Abszess, wodurch die Ausbreitung des Pilzes innerhalb der Gewebe-14. Höhere Vergrößerungen (Abbildung 1, D) zeigen, wie auch die umliegenden Gebiete von der Abszess in PMCs angereichert sind.
Durch die strukturelle Integrität, kann die Lokalisation des Erregers während der Infektion ermittelt werden. Unter Ausnutzung des erhöhten Inhalts der Polysaccharide in der Zellwand von C. Albicans, die Identifizierung des Erregers erfolgte mittels PAS Färbung, die der Pilz eine lila-Magenta-Farbe verleiht. Wie in Abbildung 2Adargestellt, zeigt PAS Färbung deutlich, dass der Erreger im Inneren der Abszess gebildet durch die Einstellung von Granulozyten14beschränkt ist. C. Albicans ist deutlich sichtbar auf die höhere Vergrößerung (Abb. 2 b), und es scheint immun und nekrotischen Zellen umgeben.
Die oben beschriebene Methode verwenden, können die Infektion und die daraus resultierende Entzündung im Laufe der Zeit verfolgt werden. Am Anfang, immun Zelle führt Rekrutierung zur Bildung eines Abszesses (Abbildung 1A und Abbildung 3A). Wenn die Analyse des Hautgewebes bis zu verlängert wurde 48-72 h, die Störung der Hautstrukturen und die Bildung einer Narbe wurde visualisiert (Abb. 3 b, C). Die Entstehung dieser Struktur ist aufgrund der Heilungsphase, die die Vertreibung der Erreger14folgt.
Der Prozess, der zur Bildung von ein Geschwür führt, kann für mehrere Tage nach der Infektion gefolgt. Wie Abbildung 4Azeigt, zeigen C57BL/6 Wildtyp Mäusen einen Colitis Prozess, der im Laufe der Zeit erhöht. Rund zeigen 70-80 % der Mäuse Bildung ein Geschwür 72 h nach der Infektion. Aufgrund der experimentellen Variabilität sollte mindestens 8 Mäuse bei jedem Versuch verwendet werden. Für statistische Analysen empfiehlt es sich, ein Minimum von 8-10 Mäuse für jede Ulzeration Partitur zu verwenden, wenn Vergleich von unterschiedlichen Genotypen oder Behandlungen. In diesem Fall sollte auch kleine Unterschiede sichtbar sein. Illustrative Bilder des Colitis-Prozesses sind in Abbildung 4 bgezeigt. Auf bestimmte Behandlungen oder genetische Mängel die Bildung des Geschwürs reduziert werden bzw.14aufgehoben. In einigen Fällen wird anstelle des Ulkus eine Zyste gebildet, wie in Abbildung 4dargestellt.
Anders als Hämatoxylin und Eosin und PAS Färbung, die Folien können auch gebeizt für entweder spezifische zelluläre Marker oder mit anderen immunhistochemische Färbungen besser visualisieren: Kollagenfasern; Cytokine/Chemokine Lage innerhalb des Gewebes; und Immunzelle Identität und räumliche Verteilung.
Neben der histologischen Vorbereitung können auch Proben für Molekulare Analysen verwendet werden. Die gesamte Injektionsstelle kann herausgeschnitten, wie histologische Präparate und für die RNA-Extraktion verarbeitet werden. RNA-Extraktion aus dem Gewebe ermöglicht das Studium und die Identifizierung von diesen Genen hochreguliert während der Infektion mit dem Erreger. Die Möglichkeit, die Proben für Molekulare Analysen zu verarbeiten ist ein wichtiges Instrument, zusammen mit der histologischen Untersuchung, um besser charakterisieren die Art der Immunantwort gegen den Erreger und deren Regulierung während der frühen und späten Phasen ausgelöst nach der Challenge14.
Abbildung 1: Pflege der Haut Morphologie und zelluläre Lokalisierung. (A) alle Schichten werden beibehalten. Epithel, Adipozyten und Muskelzellen sind leicht erkennbar. (B) Polymorphkernige Leukozyten (mit Pfeilen markiert) können innerhalb der Abszess identifiziert werden. (C, D) Höhere Vergrößerungen zeigen die Anwesenheit von polymorphkernigen Leukozyten (Pfeile) in der unmittelbaren Umgebung des Abszesses. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Identifizierung von C. Albicans. (A) C. Albicans innerhalb des Gewebes mit PAS Färbung erkannt werden. (B) höherer Vergrößerung besser visualisieren den Pilz, gebeizt in Lila, beschränkt sich im Inneren des Abszesses. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Follow-up des entzündlichen Prozesses. (A) ganz am Anfang des entzündlichen Prozesses ausgelöst durch Injektion von C. Albicans , Granulozyten werden rekrutiert, um einen Abszess zu beschränken, den Erreger zu bilden. (B, C) Die Bildung von ein Geschwür ist notwendig für die Ausweisung des Pilzes. Das heilende Gewebe zeichnet sich durch eine Veränderung in die strukturelle Integrität der Haut und führt zur Bildung einer Narbe. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Kinetik der Ulzeration. (A) die Colitis Prozess folgt einem Trend der Zunahme in den ersten Tagen nach der Infektion. 72 h nach der Infektion, 70-80 % der Mäuse zeigt ein Geschwür am Ort der Infektion. 16 C57BL/6 Wildtyp Tiere dienten. (B) anschauliche Bilder von Geschwüren, die 48 Stunden nach der Infektion entwickelt. (C) anschauliche Bilder von Zystenbildung nach Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Hier haben wir eine Methode von C. Albicans -Infektion des entzündlichen Prozesses zu studieren, die auf Pilz Eingang in die Tiefe Derma initiiert wird.
Obwohl Haut Abszessbildung ein relativ seltenes Ereignis bei C. Albicans Infektion15 ist, Injektion des Pilzes direkt in die Tiefe Derma ermöglicht es, nicht nur das Studium der Pilz-driven Abszessbildung, sondern auch die Analyse der spezifischen Immunantwort Zellen, die teilnehmen, um Pilz Ausbreitung einzudämmen. Mit dem hier beschriebenen Verfahren ist es möglich, die Interaktion zwischen Immunzellen, sowie die Rekrutierung von Immunzellen, die wichtig für die pilzartige Ausbreitung unter Vermeidung jeder entzündliche Reaktion auf mechanische Beschädigungen oder Wunde kontrollieren Bildung. In der Tat ist die Möglichkeit, die epitheliale Struktur intakt zu halten wichtig, die Entwicklung einer entzündlichen Umgebung verursacht durch einen mechanischen Reiz, wie ein Abrieb zu vermeiden. Als theoretisiert zum ersten Mal von Polly Matzinger in 199416können Schaden Signale, aktivieren Sie in der Tat eine Immunantwort und infolgedessen potent beeinflussen die Immunantwort ausgelöst durch den Erreger.
Schäden verbundenen molekulare Muster (DAMPs) können aus abgestorbenen Zellen stammen, aber sie können auch unter Stressbedingungen freigegeben werden. Da diese Signale in Situationen der Gewebeschädigung hergestellt werden können, wäre die Bildung einer Wunde eine hyper-entzündlichen Umgebung schon vor dem Hintergrund einer Infektion verursachen. Die Methode, die wir beschrieben haben schränkt die Freisetzung von Dunst und reduziert somit die Anwesenheit von verwirrende Elemente.
Darüber hinaus ist die Injektion eines Erregers direkt in die Tiefe Derma eine Methodik, die nicht nur für Pilzinfektionen, sondern auch für bakterielle Herausforderungen verwendet werden können. Ein weiterer Erreger verantwortlich für eine erhöhte Zahl von Fällen von beiden kutanen und Blutbahn Infektionen ist Staphylococcus Aureus4. Wir haben vor kurzem gezeigt, wie dieses Protokoll ist auch ein wichtiges Instrument zur S. Aureus Infektion14zu studieren. S. Aureus ist insbesondere in Klinik für seine Fähigkeit, Form Abszesse in mehreren Bezirken der Körper17bekannt. Injektion von S. Aureus in der Tiefe Derma führt zur Bildung von Abszessen, wodurch gleichzeitig die Studie der sehr frühen Ereignisse getrieben von S. Aureus zu begegnen, sowie die Einbindung von Immunreaktionen, die zur Heilung führen Phase.
Schließlich ist ein weiteres wichtiges Merkmal der hier beschriebenen Methode, dass die Aufrechterhaltung einer intakten epithelialen Struktur bietet die Möglichkeit, histologisch zu analysieren, die Lokalisierung von Immunzellen und die Aktivierung der unterschiedlichen Wege, die sein kann räumlich aufgeteilt. Unter diesen Versuchsbedingungen in der Tat die verschiedenen anatomischen Strukturen der Haut werden nicht verändert und Immunzellen und Entzündungsmediatoren in einem genau festgelegten Ort visualisiert werden.
Die Verwendung dieser Methode, die die räumliche Verteilung der Immunzellen bewahrt ist daher ideal, um besser zu verstehen, die Rollen der einzelnen zellulären während Pilz- und bakterielle Hautinfektionen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
FG ist durch Associazione Italiana per la Ricerca Sul Ariete (IG 2016Id.18842), Cariplo Foundation (Grant 2014-0655) und Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB) unterstützt.
IZ stützt sich auf NIH Grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 Grant, Harvard Medizinische Schule Milton gefunden, EKFF Senior Research Award (412708), die Eleanor und Meilen Küste 50. Jahrestag-Fellowship-Programm, und die Cariplo Foundation ( 2014-0859).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| PBS | Euroclone | ECB4053L | warm in 37 °C bath before use |
| H-OCT compound | histo-line laboratories | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | histo-line laboratories | 09-209-05 | |
| Ethanol absolute | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR | histo-line laboratories | R0050 | |
| Eukitt, mounting medium | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| PAS staining system | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Yeast Extract | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucose anhydrous for molecular biology | Applichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridine | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Safe-Lock tubes 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagent | Life Technologies | 15596018 | Toxic, corrosive and mutagen. Use all precaution needed |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| liquid nitrogen | Wear eye protection | ||
| Instrument | |||
| Coulter Counter-Particle Count | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| Materials | |||
| 0.3 ml Insulin Syringe with a 30G x 8mm needle | BD | 324826 | |
| Surgical forceps | |||
| Surgical scissors | |||
| Base mould disposable | histo-line laboratories | 2781 | |
| Positively charged bio microscope slides | bio-optica | 09-2000 | |
| Cover slips 24 x 50 mm | thermo scientific | 11911998 |
References
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