Qui descriviamo un protocollo che permette l'analisi istologica e molecolare dei campioni della pelle dopo iniezione intradermica di Candida albicans . Questo protocollo mantiene l'integrità strutturale della pelle e permette per la localizzazione di cellule del sistema immunitario del tessuto-residente o recentemente reclutate come pure la distribuzione di agente patogeno.
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Articolo metodologico
Profondo cutaneo iniezione come un modello di infezione della pelle Candida albicans per analisi istologiche
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La pelle è un organo estremamente esteso del corpo e, a causa di questa grande superficie, è continuamente esposto a microrganismi. Danni alla pelle possono portare facilmente a infezioni nel derma che può, a sua volta, provoca la diffusione di agenti patogeni nel sangue. Comprendere come il sistema immunitario combatte le infezioni allo stadio molto precoce e come l'host può eliminare gli agenti patogeni è un passo importante per impostare la base per futuri interventi terapeutici. Qui descriviamo un modello di infezione dei albicans del Candida che può visualizzare i processi che si verificano precocemente durante un'infezione, anche quando l'agente patogeno ha superato la barriera epiteliale, come pure la risposta immunitaria da albicans del c. invasione. Abbiamo usato questo modello di infezione per eseguire analisi istologiche che mostrano le cellule immunitarie che infiltrano la pelle così come la presenza e la localizzazione dell'agente patogeno. I campioni raccolti dopo l'infezione possa essere elaborato per l'estrazione di RNA.
Introduzione
Il corpo umano è ricoperto da un numero estremamente elevato di microrganismi. La superficie della pelle è l'habitat di quasi 1 milione di batteri per centimetro quadrato1. Questo numero, tuttavia, non riflette la varietà di microrganismi che colonizza la pelle. Oltre ai batteri, il corpo umano è colonizzato da numerose specie fungine, tra cui c. albicans, che è in grado di sopravvivere sia presso le mucose e la pelle livello2.
Negli ultimi anni, la percentuale di persone con diagnosticata di infezioni fungine è enormemente aumentato. Ciò è dovuto principalmente al maggior numero di p....
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Protocollo
Tutte le procedure sono state approvate sotto l'istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC) e operate sotto la supervisione del dipartimento di risorse animali ai bambini dell'ospedale (arco) al Children Hospital di Boston o sono stati approvati dall'italiano Ministero della salute e realizzata sotto il Comitato istituzionale di Animal Care presso l'Università di Milano-Bicocca.
1. preparazione di albicans del c.
- Cultura C. albicans, ceppo CAF3-113, in provette contenenti medium ricco (lievito estratto peptone destrosio (YEPD), Estratto di lievito 1% (p/v), 2% (p/v) di Bacto Peptone....
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Risultati
Attraverso l'iniezione dell'agente patogeno direttamente nel derma profondo, la morfologia strutturale del tessuto rimane intatto (Figura 1A).
Il mantenimento dell'integrità strutturale della pelle permette la rilevazione delle cellule immuni e loro localizzazione presso il sito di infezione. Il maggiore ingrandimento mostrato in Figura 1B rivela che l'ascesso si compon.......
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Discussione
Qui abbiamo descritto un metodo di c. albicans infezione per studiare il processo infiammatorio che è iniziato al fungina ingresso nel derma profondo.
Anche se la formazione di ascesso della pelle è un evento relativamente raro su c. albicans infezione15, iniezione del fungo direttamente nel derma profondo permette non solo lo studio della formazione di ascesso fungoso-driven, ma anche l'analisi di specifici immune cellule che partecipano per contenere.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
FG è supportato da Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (IG 2016Id.18842), Fondazione Cariplo (Grant 2014-0655) e Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica (FRRB).
IZ è supportato da NIH grant 1R01AI121066-01A1, 1R01DK115217, HDDC P30 DK034854 grant, Harvard Medical School Milton trovato, CCFA Senior Research Awards (412708), il Eleanor e il Miles Shore 50 ° anniversario Fellowship Program e la Fondazione Cariplo ( 2014-0859).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagenti | |||
| PBS | Euroclone ECB4053L | caldo in 37 gradi C bagno prima dell'uso | |
| Composti H-OCT | laboratori histo-line | R0030 | |
| Gill's Hematoxilyn | histo-line laboratories | 09-178-2 | |
| Soluzione di eosina Y, | laboratori isto-line | 09-209-05 | |
| Etanolo assoluto | scharlau | ET00232500 | |
| Citro-HISTOCLEAR histo-lineR0050 | |||
| Eukitt, terreno di montaggio | bio-optica | ||
| Acetone | sigma-aldrich | 179124 | |
| sistema di colorazione PAS | sigma-aldrich | 395B-1KT | |
| Bacto Peptone | BD | 211677 | |
| Bacto Estratto di lievito | BD | 212750 | |
| D(+)-Glucosio anidro per biologia | molecolareApplichem PanReac | 50-99-7 | |
| Uridina | Merck Millipore | 8451 | |
| HEPES | Applichem PanReac | A1070,0500 | |
| Provette Safe-Lock 2 mL | eppendorf | 30121597 | |
| TRIzol Reagente | Life Technologies | 15596018 | Tossico, corrosivo e mutageno. Utilizzare tutte le precauzioni necessarie |
| Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | |
| azoto | Indossare una protezione per gli occhi | ||
| Instrument | |||
| Coulter Conteggio delle controparticelle | Beckman Coulter | ||
| Centrifuge 5415 R | eppendorf | ||
| MC 3000 Microtome Cryostat | histo-line laboratories | ||
| TissueLiser | QIAGEN | ||
| strong>Materiali | |||
| 0,3 ml Siringa da insulina con ago da 30 G x 8 mm... | BD | 324826 | |
| Pinze | |||
| Forbici | |||
| Stampo base monouso | laboratori histo-line | 2781 | |
| Vetrini per biomicroscopio | bio-optica | 09-2000 | |
| Vetrini coprioggetti 24 x 50 mm | termo scientifici | 11911998 |
Riferimenti
- Belkaid, Y., Segre, J. A. Dialogue between skin microbiota and immunity. Science. 346 (6212), 954-959 (2014).
- Kashem, S. W., Kaplan, D. H. Skin Immunity to Candida albicans. Trends Immunol. 37 (7), 440-450 (2016).
- Havlickova, B., Czaika, V. A., Friedrich, M.
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Ristampe e permessi
